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Rapid Determination of High-Resolution Protein Structures by Solution and Solid-state NMR Spectroscopy

Beschleunigung der Bestimmung von hochaufgelösten Lösungs- und Festkörper-NMR Strukturen

by Jegannath Korukottu
Doctoral thesis
Date of Examination:2008-01-22
Date of issue:2008-04-08
Advisor:Dr. Markus Zweckstetter
Referee:Prof. Dr. Christian Griesinger
Referee:Prof. Dr. Annette Zippelius
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3405

 

 

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Name:korukottu.pdf
Size:3.83Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

NMR spectroscopy provides high-resolution structural information of biomolecules in near-physiological conditions. Structural studies of proteins and nucleic acids are critical for understanding biological processes at the molecular level. Although significant improvements were achieved in NMR spectroscopy in the last 20 years, the increase in genome sequencing data has created a need for rapid and efficient methods of NMR-based structure determination. NMR data acquisition can be accelerated significantly, when sensitive spectrometers are combined with new methods for sampling chemical shifts in multidimensional NMR experiments. Therefore, data analysis and in particular the requirement to assign side chain chemical shifts to specific atoms is the major bottleneck of rapid NMR-based structure determination. In chapter 2, a method termed FastNMR (FAst STructure determination by NMR), is described in detail, which enables automatic, high-resolution NMR structure determination of domain-sized proteins starting from unassigned NMR data. Using FastNMR the de novo structure of the 65-residue cone snail neurotoxin conkunitzin-S2 was determined automatically. Large classes of proteins, such as membrane proteins and insoluble aggregates of peptides and more complex systems, cannot be investigated with the above method, because the proteins cannot be made soluble for liquid-state NMR. Therefore, there is a considerable interest in the development of methods for protein structure determination that do not have these limitations. In chapter 3 and 4 of this thesis, it is demonstrated that, combining the knowledge obtained in solution-state NMR, a rapid determination of high-resolution protein structure of globular proteins, such as, potassium channel blocker, Kaliotoxin existing in free form and also in complex with KcsA-Kv1.3, from solid-state NMR data could be obtained. Also in chapter 4, an improved model of KTX-KcsA-Kv1.3 complex is proposed based on functional and solid-state NMR data. Finally, chapter 5 sheds light on understanding the mechanism of alignment of proteins and efforts in improving the accuracy of prediction of charge-induced molecular alignment from the protein's known 3D structure, by employing more atomistically detailed electrostatic models. Preliminary results suggest that the accuracy in predicting RDCs and magnitude of alignment using detailed electrostatics might improve in comparison with the simplified model implemented in PALES.
Keywords: Liquid-state; NMR Spectroscopy; Protein Structures; Solid-state; Kaliotoxin; Potassium channel; protein structure determination

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NMR-Spektroskopie ermöglicht die Bestimmung hoch-aufgelöster Strukturen von Biomolekülen unter nahezu physiologischen Bedingungen. In den letzten 20 Jahren wurden erhebliche Fortschritte in der NMR-Spektroskopie erzielt, durch die Vielzahl sequenzierter Genome werden jedoch Hochdurchsatzverfahren zur Bestimmung der Tertiärstruktur von Proteinen immer wichtiger. Die Datenaufnahme kann erheblich beschleunigt werden, wenn moderne NMR-Spektrometer mit Methoden kombiniert werden, welche effizient chemische Verschiebungen in mehrdimensionalen NMR-Experimenten messen. Daher sind die Datenanalyse und insbesondere die Notwendigkeit, chemische Verschiebungen sequenzspezifisch den Atomen der Seitenketten zuzuordnen, die Haupthindernisse für eine schnelle NMR-basierte Proteinstrukturbestimmung. In Kapitel 2 wird die Methode FastNMR (FAst STructure determination by NMR) beschrieben, welche ausgehend von nicht zugeordneten NMR-Daten die automatische Bestimmung hoch-aufgelöster Strukturen von Proteinen - die aus einer Domäne bestehen - ermöglicht. Mittels FastNMR wurde automatisch die de novo Struktur des aus 65 Aminosäuren bestehenden, aus Kegelschnecken stammenden Neurotoxins Conkunitzin-S2 bestimmt. Eine große Zahl von Proteinen, wie z.B. Membranproteine oder unlösliche Aggregate von Peptiden und komplexeren Systemen, läßt sich allerdings nicht mit den zuvor beschrieben Methoden untersuchen, da diese Proteine nicht in Lösung gebracht werden können, um mit Hilfe von Lösungs-NMR untersucht zu werden. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Methoden zur Proteinstruktur-Aufklärung, die nicht auf Lösungs-NMR beschränkt sind. In Kapitel 3 und 4 dieser Arbeit wird gezeigt, dass mit Hilfe der in Lösung-NMR gewonnen Erkenntnisse eine schnelle Aufklärung von globulären Proteinen, wie z.B. dem Kaliumkanal-Blocker Kalitoxin - in der freien Form als auch in der im Komplex mit KcsA-Kv1.3 gebunden Form - durch Festkörper-NMR möglich ist. Ebenfalls in Kapitel 4 wird ein verfeinertes Model des KTX-KcsA-Kv1.3 Komplexes vorgestellt auf der Grundlage von biochemischen Daten und Festkörper-NMR Ergebnissen. Im fünften und letzten Kapitel wird ein besseres Verständnis des Orientierungsmechanismus von Proteinen erarbeitet und erste Ansätze für eine verbesserte Vorhersage der ladungsinduzierten Orientierung von Proteinen vorgestellt. Ausgehend von einer bekannten dreidimensionalen Struktur des Moleküls wird dazu ein verbessertes elektrostatisches Modell angewendet. Erste Ergebnisse deuten an, daß die Vorhersagekraft durch ein detailliertes elektrostatisches Modell gegenüber der des einfachen und in PALES implementierten Modells sich leicht verbessern könnte.
Schlagwörter: Lösungs; NMR-Spektroskopie; Proteinen Strukture; Festkörper; Kaliotoxin; Kaliumkanal; Proteinstrukturbestimmung
 

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