Rapid Determination of High-Resolution Protein Structures by Solution and Solid-state NMR Spectroscopy

Abstract

NMR-Spektroskopie ermöglicht die Bestimmung hoch-aufgelöster Strukturen von Biomolekülen unter nahezu physiologischen Bedingungen. In den letzten 20 Jahren wurden erhebliche Fortschritte in der NMR-Spektroskopie erzielt, durch die Vielzahl sequenzierter Genome werden jedoch Hochdurchsatzverfahren zur Bestimmung der Tertiärstruktur von Proteinen immer wichtiger. Die Datenaufnahme kann erheblich beschleunigt werden, wenn moderne NMR-Spektrometer mit Methoden kombiniert werden, welche effizient chemische Verschiebungen in mehrdimensionalen NMR-Experimenten messen. Daher sind die Datenanalyse und insbesondere die Notwendigkeit, chemische Verschiebungen sequenzspezifisch den Atomen der Seitenketten zuzuordnen, die Haupthindernisse für eine schnelle NMR-basierte Proteinstrukturbestimmung. In Kapitel 2 wird die Methode FastNMR (FAst STructure determination by NMR) beschrieben, welche ausgehend von nicht zugeordneten NMR-Daten die automatische Bestimmung hoch-aufgelöster Strukturen von Proteinen - die aus einer Domäne bestehen - ermöglicht. Mittels FastNMR wurde automatisch die de novo Struktur des aus 65 Aminosäuren bestehenden, aus Kegelschnecken stammenden Neurotoxins Conkunitzin-S2 bestimmt. Eine große Zahl von Proteinen, wie z.B. Membranproteine oder unlösliche Aggregate von Peptiden und komplexeren Systemen, läßt sich allerdings nicht mit den zuvor beschrieben Methoden untersuchen, da diese Proteine nicht in Lösung gebracht werden können, um mit Hilfe von Lösungs-NMR untersucht zu werden. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Methoden zur Proteinstruktur-Aufklärung, die nicht auf Lösungs-NMR beschränkt sind. In Kapitel 3 und 4 dieser Arbeit wird gezeigt, dass mit Hilfe der in Lösung-NMR gewonnen Erkenntnisse eine schnelle Aufklärung von globulären Proteinen, wie z.B. dem Kaliumkanal-Blocker Kalitoxin - in der freien Form als auch in der im Komplex mit KcsA-Kv1.3 gebunden Form - durch Festkörper-NMR möglich ist. Ebenfalls in Kapitel 4 wird ein verfeinertes Model des KTX-KcsA-Kv1.3 Komplexes vorgestellt auf der Grundlage von biochemischen Daten und Festkörper-NMR Ergebnissen. Im fünften und letzten Kapitel wird ein besseres Verständnis des Orientierungsmechanismus von Proteinen erarbeitet und erste Ansätze für eine verbesserte Vorhersage der ladungsinduzierten Orientierung von Proteinen vorgestellt. Ausgehend von einer bekannten dreidimensionalen Struktur des Moleküls wird dazu ein verbessertes elektrostatisches Modell angewendet. Erste Ergebnisse deuten an, daß die Vorhersagekraft durch ein detailliertes elektrostatisches Modell gegenüber der des einfachen und in PALES implementierten Modells sich leicht verbessern könnte.