dc.contributor.advisor | Ficner, Ralf Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Wohlwend, Daniel | de |
dc.date.accessioned | 2013-01-22T15:40:44Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:50:58Z | de |
dc.date.issued | 2008-03-18 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F130-6 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3414 | |
dc.description.abstract | Der aktive Transport von cytoplasmatischen
Substraten in den Nucleus wird von Transportrezeptoren vermittelt,
welche auch Importine genannt werden. Unter ihnen ist der
Kernimportrezeptor Importinβ (Impβ) der wohl vielseitigste: Impβ
ist sowohl als einzelner Rezeptor aktiv, als auch im Verbund mit
anderen Rezeptoren oder Adaptern. Beispiele für letztere sind der
Kernimport von Substraten mit klassischem Kernlokalisationssignal
(cNLS-Substrate) gemeinsam mit dem Adapterprotein Importinα (Impα),
der Kernimport von H1 Linker Histonen mithilfe des Co-Rezeptors
Importin7 (Imp7) und der Kernimport spleißosomaler Untereinheiten,
der U snRNPs, im Verbund mit Snurportin1 (SPN1). Diese
außergewöhnliche Variabilität von Impβ stand im Mittelpunkt der
vorliegenden Arbeit und ihre Ursachen sollten thermodynamisch und
strukturell ergründet werden, mit besonderer Fokussierung auf den
H1-Kernimport und den Kernimports von U snRNPs. Beim Kernimport von
H1 Linker Histonen binden zwar sowohl Impβ als auch Imp7 an das
Substrat, jedoch nur als Heterodimer können sie die Translokation
von H1 durch die Kernpore bewältigen. In dieser Arbeit konnte die
H1-Bindungsstelle von Imp7 ermittelt werden, welche zwei saure
Bereiche nahe dem C-Terminus umfaßt, die als mögliche Schleifen
identifiziert wurden. Die thermodynamische Analyse der Bildung des
H1-Importkomplexes aus Impβ, Imp7 und H1 und seiner Dissoziation
durch RanGTP mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC)
zeigte, daß beide Prozesse allosterisch reguliert sind. Dabei
konnte dargelegt werden, daß die Bildung des Impβ/Imp7-Heterodimers
in vitro enthalpiegetrieben ist, wohingegen die nachfolgende
H1-Bindung an das Heterodimer entropiegetrieben ist. Der
erforderliche Entropiegewinn wird dabei durch die Freisetzung von
Salzionen von der H1-Oberfläche durch die komplementär zu H1
geladene, gemeinsame Oberfläche von Impβ und Imp7 bereitgestellt.
Hieraus ist ersichtlich, daß die Energiebarriere bei der H1-Bindung
durch den Einsatz eines Rezeptordimers überwunden wird. Außerdem
konnte nachgewiesen werden, daß der H1-Bindung eine allosterische
Aktivierung von Imp7 durch Impβ vorausgeht, bei welcher die
Impβ-Bindungsdomäne von Imp7 eine Schlüsselrolle spielt. Im
Kernimport von U snRNPs dagegen bedient sich Impβ nicht eines
Co-Rezeptors, sondern eines Adapters für das Substrat, nämlich
SPN1. Im Gegensatz zu allen anderen bislang untersuchten
Impβ-abhängigen Kernimportprozessen bedarf der Impβ/SPN1/U
snRNP-Importkomplex für die Freisetzung vom nuclear basket nach dem
Import jedoch nicht des Schalterproteins RanGTP. Die hier
vorgestellte Kristallstruktur von Impβ_127-876 im Komplex mit der
Impβ-Bindungs-Domäne von SPN1 (IBBSPN1, AS 1-65) offenbart eine
weit geöffnete Konformation von Impβ, wie sie einzigartig unter den
funktionellen Impβ/Substrat-Komplexen ist. Überraschenderweise
gleicht sie vielmehr der Konformation von Impβ/RanGTP. Da die
Bindung von RanGTP an Impβ üblicherweise die Freisetzung von
Importkomplexen vom nuclear basket auslöst, kann die
Schlußfolgerung gezogen werden, daß die freie Dissoziation von
Impβ/SPN1 vom nuclear basket durch die Mimikry des
RanGTP-gebundenen Zustands ermöglicht wird. Mittels ITC konnte
überdies eine Korrelation zwischen der offenen Konformation von
Impβ im Komplex mit IBBSPN1 und seiner hohen Molekülentropie belegt
werden. Dies steht im Gegensatz zur geschlossenen und daher
entropiearmen Konformation von Impβ im Komplex mit Impα. Die hier
vorgestellten Ergebnisse verdeutlichen also die zentrale Rolle von
molekularen Modulationen im Impβ-abhängigen Kernimport und geben
neue Einblicke in Strategien, die Energiebarrieren im Kernimport zu
überwinden. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | ger | de |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ | de |
dc.title | Thermodynamische und strukturelle Charakterisierung Importinβ-abhängiger Kernimportprozesse | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Thermodynamical and structural characterisation of importinβ dependent nuclear import processes | de |
dc.contributor.referee | Ficner, Ralf Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2008-01-22 | de |
dc.subject.dnb | 570 Biowissenschaften, Biologie | de |
dc.subject.gok | WA 000 | de |
dc.description.abstracteng | Active nuclear transport of cytoplasmic
substrates into the nucleus is mediated by transport receptors also
termed importins. Among them the nuclear import receptor importinβ
(Impβ) is presumably the most versatile one: it is not only active
as single receptor, but also in cooperation with other receptors or
adaptors. As examples for the latter ones shall be named the
nuclear import of substrates with classical nuclear localisation
signal (cNLS substrates) together with the adaptor protein
importinα (Impα), the nuclear import of H1 linker histones aided by
the coreceptor importin7 (Imp7) and finally the nuclear import of
spliceosomal subunits, the U snRNPs in cooperation with snurportin1
(SPN1). This extraordinary variability of Impβ was the focus of the
work presented here and its basis should be fathomed in both
thermodynamical and structural approaches with special attention to
H1 nuclear import and the nuclear import of U snRNPs. In the
nuclear import of H1 linker histones both Impβ and Imp7 separately
interact with H1, however, only as a dimer they facilitate the
translocation through the nuclear pore. In this study the H1
binding site of importin7 could be identified, comprising two
extended acidic regions near the Cterminus of importin7, which
could be classified to be putative loops. The thermodynamic
analysis of the H1 import complex assembly and also its disassembly
by RanGTP by means of isothermal titration calorimetry revealed
both processes are regulated allosterically. Concomitantly it could
be demonstrated that the formation of a receptor heterodimer in
vitro is an enthalpy-driven process, while subsequent binding of H1
to the heterodimer is entropy-driven. The necessary gain of entropy
for H1 binding is provided by the displacement of counter-ions from
the H1 surface by the complementarily charged joint binding surface
of Impβ and Imp7. From this it can be followed, that by the
application of an import receptor dimer the energy-balance of H1
import is evened. Furthermore, it could also be verified that
substrate recognition is preceded by an allosteric activation of
Imp7 by Impβ, in which the Impβ-binding domain of Imp7 plays a key
role. In the nuclear import of U snRNPs however, Impβ does not
avail itself of a co-receptor but an adaptor to the substrate,
namely SPN1. In contrast to any other characterised Impβ-dependent
nuclear import the Imp /SPN1/U snRNP complex does not require the
switch protein RanGTP for the terminal release from the nuclear
basket of the nuclear pore complex (NPC). The crystal structure of
Impβ_127-876 in complex with the importin -binding-domain of SPN1
(IBBSPN1, aa 1-65) presented here reveals that Impβ adopts a widely
opened conformation, which is unique for a functional Imp /cargo
complex and surprisingly it rather resembles the conformation of
the Impβ/RanGTP complex. As binding of RanGTP to Imp usually
triggers the release of import complexes from the NPC, it is
proposed that the free dissociation of Imp /SPN1 from the nuclear
basket is allowed by the mimicry of the RanGTP-bound state.
Moreover, by means of ITC a correlation between the open
conformation of Impβ in complex with IBBSPN1 and its high entropy
state could be documented. This is in contrast to the closed and
thus entropically low-levelled conformation of Impβ in complex with
Impα. Consequently the results presented here underline the central
role of molecular modulation in Impβ-dependent nuclear transport
and provide new insights into strategies to overcome
energy-barriers in nuclear transport. | de |
dc.contributor.coReferee | Einsle, Oliver Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Natural Science | de |
dc.subject.ger | Kerntransport | de |
dc.subject.ger | Kernimport | de |
dc.subject.ger | NPC | de |
dc.subject.ger | Importinβ | de |
dc.subject.ger | Importin7 | de |
dc.subject.ger | Linker Histon | de |
dc.subject.ger | Spleißosom | de |
dc.subject.ger | U snRNP | de |
dc.subject.ger | RanGTP | de |
dc.subject.eng | nuclear transport | de |
dc.subject.eng | nuclear import | de |
dc.subject.eng | NPC | de |
dc.subject.eng | importinβ | de |
dc.subject.eng | importin7 | de |
dc.subject.eng | linker histone | de |
dc.subject.eng | spliceosome | de |
dc.subject.eng | U snRNP | de |
dc.subject.eng | RanGTP | de |
dc.subject.bk | 30.42 | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1736-7 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-1736 | de |
dc.identifier.ppn | 588951870 | de |