NMR Spectroscopic studies of calmodulin plasticity in calcium signalling
Untersuchung der Plastizität vom Calmodulin in der Signalübertragung von Calciumionen mittels NMR-Spektroskopie
by Fernando Alfredo Rodriguez-Castaneda
Date of Examination:2007-11-05
Date of issue:2008-03-18
Advisor:Prof. Dr. Christian Griesinger
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Dr. Thomas Jovin
Referee:Prof. Dr. Nils Brose
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The present work focused both in structural and dynamic studies on the ubiquitous Ca2+ signaling protein calmodulin. Calmodulin has been extensively studied both for its biological importance in the regulation of its interaction partners which are key regulators in various processes like protein phosphorylation, dephosphorylation and regulation of gene transcription and as a two-domain model protein, binding the signaling calcium ion in a cooperative fashion. Pioneering high-resolution structural studies both by X-ray crystallography (Babu et al., 1988) and NMR (Ikura et al., 1992; Barbato et al., 1992) done on calmodulin revealed that its two domains are linked by a flexible linker giving a large degree of conformational freedom. Thus, its two domains can adopt various orientations to recognize and activate its targets. Upon calcium binding, the EF-hand motifs in CaM undergo a large conformational change exposing hydrophobic side-chains to the surface, which engage in hydrophobic interactions with its targets. Among this hydrophobic side chains, methionines play a prominent role in CaM plastic interactions (Siivari et al., 1995). The dynamic part of the investigation made use of anisotropic NMR restraints that sample protein motions up to the submillisecond time-scale. In solution-state NMR, anisotropic interactions average to zero due to molecular tumbling. For this reason, these anisotropic interactions are observable (and measurable) just under special sample conditions. In this work, the use of lanthanide-binding EDTA-based paramagnetic tags attached to cysteine mutants in CaM served this purpose; since the unpaired electron in the paramagnetic lanthanide ion provides strong magnetic susceptibility anisotropy, aligning the macromolecule in solution. Using this methodology, it was possible to establish a difference in the CaM dynamics in three different activated sates (apoCaM, holoCaM and CaM-C20W peptide complex). First, the paramagnetic alignment of the CaMS17C mutant established a difference in the dynamic behavior of apoCaM and holoCaM on the basis of pseudocontact shifts measured in the linker region of CaM. Second, the measurement of residual dipolar couplings from the paramagnetic alignment of the CaMT146C mutant in the free state and in complex to the C20W peptide belonging to the plasma membrane Ca2+-pump, established a difference in the dynamics between these two activated states. Bertini et al. 2004, reported a reduced alignment for the C-terminal domain of CaM (around 10% of the alignment was retained) mutant by direct lanthanide binding to the metal binding site in the N-terminal domain of holoCaM. In this work, a consistent reduced alignment in three independent measurements of ~25% in the N-terminal domain of CaM in complex with the C20W peptide is reported. In contrast, for the holoCaM case, a residual alignment of the N-terminal domain of CaM could not be measured because of the weak alignment impaired by the paramagnetic tag (up to 8Hz at 900 MHz) yielding rDC within the error range of the measurements. The structural part of the investigation focused in the interaction of CaM with the diacylglycerol-binding protein Munc13-1, an essential protein involved in the priming process of vesicles in neurotransmitter release. Junge et al., 2004 found that CaM binds to a conserved region in Munc13-1 and regulates neurotransmitter release in response to residual calcium signals. The complete sequential resonance assignment and determination of the NMR solution structure of the CaM/Munc13-1 (458-492) peptide complex is reported. The 1H, 15N, and 13C resonance assignment list has been deposited to the biological magnetic resonance data bank (BMRB): deposition number 15470. The structure describes a new binding motif for CaM, where CaM interacts with Munc13-1 in a bipartite mode. The C-terminal domain of CaM interacts with the N-terminal amphiphilic -helical (1-5-8) hydrophobic motif of the Munc13-1 peptide and the N-terminal domain of CaM builds a hydrophobic interaction with a LW motif at the C-terminus of the peptide. Other singular properties of this protein-peptide complex include residual interdomain dynamics in the submillisecond time scale probed by paramagnetically-derived residual dipolar couplings; and monomer-dimer equilibrium to a (2:2) complex favored at larger salt concentrations. Electrophisiology studies done on primary neuron cultures of the CaM insensitive (W464R) and the phorbol ester insensitive (H567K) mutants (Junge et al., 2004; Rhee et al., 2002) of Munc13-1 have revealed striking similarities in their vesicle priming properties. This motivated the study of the interaction of CaM with a fragment of Munc13-1 containing both the CaM-binding and the diacylglycerol/phorbol ester-C1 binding domains of Munc13-1. The 15N-labeled NMR sample for this protein-protein complex could be prepared using a co-expression approach and allowed its spectroscopic investigation. Although the sequential backbone resonance assignment for this CaM/Munc13-1(447-631) protein complex was not undertaken, the similarity to the HSQC of the CaM/Munc13-1 (458-492) peptide complex allowed the description of several novel properties of this protein-protein interaction. First, the monomer(1:1)-dimer (2:2) equilibrium described for the CaM/Munc13-1(458-492) peptide complex is also described in this larger complex, but with an increased binding affinity. Therefore, the monomeric and dimeric complex species could be separated by size-exclusion chromatography and studied independently. The analysis of the HSQC spectra of the monomeric complex species of the wild type, W489A and W588A mutant complexes suggest that the N-terminal domain of CaM switches between two hydrophobic motifs in Munc13-1: the LW motif revealed in the NMR structure and a second motif within the C1 domain of Munc13-1. The rigorous proof of a direct interaction between the N-terminal domain of CaM and the C1 domain of Munc13-1 is not provided, but ongoing studies is addressing this possibility that would give a structural correlate to the physiological studies mentioned before. The studies on the dimeric (2:2) CaM/Munc13-1(447-631) protein complex also suggest a conformational exchange equilibrium mediated by the N-terminal domain of CaM and the C1 domain of Munc13-1. Moreover, there is preliminary evidence that the C1 domain agonist PDBu might activate Munc13-1 by shifting the equilibrium towards the monomeric state of the complex, possibly relieving an auto-inhibited state. The homodimerization of the C2A domain of Munc13-1 has been described in the studies by Lu et al., 2006. For this reason, further studies on the relationship of the oligomerization state of Munc13-1 and its priming activity are highly encouraged to better understand how the variable N-terminal region of Munc13 proteins with its numerous interaction partners like RIM1 and Rab3A (Dubulova et al., 2005) remodels the highly conserved C-terminal MUN catalytic domain in this family of proteins to fine-tune the priming of vesicles in the active zone of neurons and more importantly how these different protein-protein interactions shape the short-term synaptic plasticity processes in the brain.
Keywords: Calmodulin; NMR; Protein Dynamics; Protein Structure; Munc13; Neurotransmitter release
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Dieser Arbeit befasst sich mit den
strukturellen und dynamischen Aspekten der Kalzium Signal
Transduktion von Calmodulin (CaM). Dieses Protein ist intensiv
erforscht worden, da es eine Vielzahl von Interaktionspartnern
reguliert und in Schlüsselprozessen, wie Proteinphosphorylierung,
-dephosphorylierung und Transkription involviert ist. Darüber
hinaus ist ein Model eines Zwei-Domänen-Proteins, welches Kalzium
kooperativ bindet. Die strukturelle Pionierarbeit, sowohl
kristallographisch (Babu et al., 1988), als auch
NMR-spektroskopisch (Ikura et al., 1992; Barbato et al., 1992) hat
gezeigt, dass beide Calmodulindomänen durch einen flexibler Linker
verbunden sind, was ein hohes Maß an konformativer Freiheit
zulässt. Bedingt dadurch können beide Domänen unterschiedliche
Orientierungen einnehmen, um ihre Interaktionspartner zu erkennen
und zu aktivieren. Nach der Kalziumbindung erfahren die
EF-Hand-Motive eine umfangreiche Konformationsänderung, wodurch
hydrophobe Seitenketten auf der Oberfläche präsentiert werden und
eine hydrophobe Wechselwirkung mit ihren Partnern eingehen. Hierbei
spielen besonders Methioninseitenketten eine wichtige Rolle
(Siivari et al., 1995).
Der Teil, der sich mit der Dynamik von CaM befasst, nutzt
anisotrope NMR Bedingungen, um Bewegungsvorgänge im bis zum
Millisekundenbereich „abzutasten“. In Lösung belaufen sich solche
anisotropen Interaktionen, bedingt durch die Molekularbewegung, im
Durchschnitt auf Null. Daher lassen sie sich nur unter speziellen
Probenbedingungen beobachten (und messen). Im Rahmen dieser Arbeit
wurden Lanthanoid-komplexierte, auf EDTA-basierende,
paramagnetische Tags verwendet, die über Cysteinseitenketten an CaM
gebunden sind. Das allein stehende ungepaarte Elektron des
paramagnetischen Lanthanoid-Ions bewirkt eine starke anisotropische
magnetische Suszeptibilität, die das Makromolekül im Magnetfeld
ausrichtet. Mit dieser Methode war es möglich, Unterschiede
zwischen drei aktivierten Zuständen von CaM zu untersuchen (apoCaM,
holoCaM und CaM-C20W-Peptid-Komplex). Dabei zeigte die
paramagnetische Anordnung der CaM-S17C Mutante einen Unterschied im
dynamischen Verhalten zwischen apoCaM und holoCaM anhand von, in
der Linker-Region gemessener, Pseudokontaktverschiebungen. Durch
die Messung dipolarer Kopplungen der CaM-T146C Mutante im freien
und komplexierten Zustand mit dem Peptid (C20W) der
membrangebundenen Ca2+-ATPase-Pumpe, konnten ebenfalls Unterschiede
im dynamischen Verhalten beobachtet werden. Bertini et al. (2004)
beschrieb eine verbliebene Ausrichtung der C-terminalen Domäne von
rund 10%, wenn ein Lanthanoid-Ion direkt N-terminal von holoCaM
gebunden wird. In dieser Arbeit konnte, übereinstimmend in drei
unabhängigen Messungen, eine verbliebene N-terminale Ausrichtung
von 25% im Komplex mit C20W beobachtet werden. Im Gegensatz dazu
wurde für den N-Terminus von holoCaM keine verbliebene Orientierung
gemessen, da das Alignment des paramagnetischen tags (bis zu 8 Hz
dipolare Kopplungen am 900 MHz Spektrometer) zu schwach ist und die
Ergebnisse in der Grössenordnung des Fehlerbereiches liegen.
Der strukturelle Teil der Arbeit befasst sich mit der Interaktion
von CaM mit dem Diacylglycerol-bindinden Protein Munc13-1, welches
eine wichtige Rolle hinsichtlich Neurotransmitterfreisetzung
spielt. Junge et al., (2004) fand heraus, dass CaM an eine
konservierte Region von Munc13-1 bindet und als Antwort auf
Kalziumsignale die Freisetzung solcher Neurotransmitter reguliert.
Die vollständige sequenzielle Zuordnung der chemischen
Verschiebungen und die gelöste NMR-Struktur des CaM/Munc13-1
(458-492) Peptid Komplexes wird in dieser Arbeit beschrieben. Die
1H, 15N, und 13C chemischen Verschiebungen wurden auf der
Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB) unter der Nummer
15470 abgelegt. Die Struktur beschreibt ein neues bindendes Motiv
für CaM, in dem es mit Munc13-1 in zweiteiliger Weise interagiert.
Die C-terminale Domäne vom CaM wechselwirkt hierbei mit dem
N-terminalen, amphiphilen und -helikalen (1-5-8) Motiv des
Munc13-1 Peptids und der CaM-N-terminalen Domäne, so dass eine
hydrophobe Interaktion durch eine LW Motiv am C-terminus des
Peptids aufgebaut wird. Zu den weiteren Eigenschaften dieses
Protein-Peptid Komplexes zählt eine verbliebene Inter-Domänen-
Dynamik im sub-Millisekundenbereich, die mittels paramagnetischer
dipolarer Kopplungen untersucht wurde, sowie die Verschiebung eines
Monomer-Dimer Gleichgewichtes in Richtung eines 2:2 Komplexes,
unter Verwendung höherer Salzkonzentrationen. Electrophysiologische
Studien an primären Neuronalkulturen von Munc13-1 Mutanten, die
eine Unempfindlichkeit gegenüber CaM (W464R) und Phorbolester
(H567K) aufweisen, zeigten eine vergleichbare Eigenschaft
hinsichtlich der Auflösung von Neurotransmittervesikeln (Junge et
al., 2004; Rhee et al., 2002). Dies wiederum regte die Studie der
Interaktion zwischen CaM und einem Fragment von Munc13-1 an,
welches beide, die CaM- und Diacylglycerol/Phorbolester-C1 bindende
Domäne enthält. Die 15N markierte NMR Probe zur Untersuchung dieses
Protein-Protein Komplexes, konnte mittels einer Co-Expression
hergestellt und anschließend untersucht werden. Die Ähnlichkeiten
zwischen den HSQC-Spektren des CaM/Munc13-1(458-492) Komplexes und
des CaM/Munc13-1(447-631) Proteinkomplexes ermöglichten die
Beschreibung einiger neuer Eigenschaften dieses Protein-Protein
Komplexes, obwohl keine sequentielle Zuordnung des
CaM/Munc13-1(447-631) Komplexes vorgenommen wurde. Erstens, das für
den CaM/Munc13-1(458-492) Komplex bereits beschriebene Monomer
(1:1)- Dimer (2:2)-Gleichgewicht, ist für den größeren Komplex
ebenfalls zu beobachten, jedoch mit einer erhöhten
Bindungs-Affinität. Daher war es möglich, das Monomer vom Dimer
mittels Größenausschlusschromatographie zu trennen, um jede Spezies
unabhängig voneinander untersuchen zu können. Die HSQC-Analyse des
monomeren Komplexes des Wildtyps, sowie der W489A- und
W588A-Mutanten weist darauf hin, dass die N-terminale Domäne von
CaM zwischen zwei hydrophoben Motiven in Munc13-1 wechselt: das LW
Motiv, gezeigt in der NMR Struktur, und ein zweites Motiv,
innerhalb der C1-Domäne von Munc13-1. Der entscheidende Beweis für
die Interaktion zwischen der N-terminalen Domäne vom CaM und der
C1-Domäne vom Munc13-1 konnte nicht erbracht werden, aber laufende
Studien untersuchen diese Möglichkeit, die eine Brücke zwischen die
strukturellen und den genannten physiologischen Studien schlagen
würde. Die Untersuchungen des CaM/Munc13-1(447-631)-Dimer-(2:2)
Komplexes legen einen konformativen Gleichgewichtsaustausch
zwischen der N-terminalen Domäne vom CaM und der C1-Domäne von
Munc13-1 nahe. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass der
C1-Domänen-Agonist PDBu von Munc13-1 eine Verschiebung des
Gleichgewichts in Richtung des Monomers bewirkt, möglicherweise
bedingt durch eine reduzierte Autoinhibition. Die Homodimerisierung
der C2A Domäne von Munc13-1 wurde in den Studien von Lu et al.
(2006) bereits beschrieben. Daher sind weitere Studien, die das
Verhältnis zwischen dem Oligomerisierungszustand von Munc13-1 und
der Regulation der Neurotransmitterfreisetzung untersuchen,
wichtig, um besser verstehen zu können, wie die hoch konservierte
C-terminale MUN-Domäne von Interaktionspartnern, wie RIM1 und
Rab3A, von der variablen N-terminalen Region der Munc13-Proteine
verändern wird. Dies führt zu einer Feinabstimmung der
Neurotransmitterfreisetzung im aktiven Bereich der Neuronen.
Darüber hinaus gilt es zu klären, wie diese verschiedenen
Protein-Protein-Interaktionen die kurzzeitig plastischen Prozesse
im Gehirn bewirken könnten.
Schlagwörter: Calmodulin; NMR; Protein Dynamik; Protein Struktur; Munc13; Neurotransmitterfreisetzung