Membranglykoprotein M6a: Expression und Regulation im Gehirn unter Stress

Abstract

Glykoprotein M6a ist ein in Neuronen exprimiertes Transmembranprotein und gehört zu der Familie der Myelin Proteolipidproteine (PLP-Familie). In vitro Studien haben M6a als einen Schlüsselmodulator des Neuritenauswuchses und der Dornfortsatz-Bildung identifiziert, jedoch ist die genaue subzelluläre Verteilung von M6a innerhalb von Neuronen nicht bekannt. Die Expression von M6a wird im Hippocampus von Tieren unter psychosozialem Stress induziert aber eine stress-induzierte Regulation in weiteren Bereichen des Gehirns ist nicht untersucht. Es ist allgemein anerkannt, dass Stress zu anormaler neuronaler Plastizität führen kann, was auch zur Bildung der Hypothese beitrug, dass stress-induzierte, morphologische Veränderungen des Hippocampus und des präfrontalen-Cortex zur Entwicklung von stress-ähnlichen neurologischen Erkrankungen wie z.B. Depression, beitragen könnten. Das Ziel der vorliegenden Studie war daher, die regionale Expression des Membranglykoproteins M6a im Gehirn zu charakterisieren und den Effekt von Stress auf die Expression von M6a im präfrontalen Cortex, von in ihrer Bewegung eingeschränkten (chronically restrained) und somit unter Stress gesetzten Ratten zu analysieren. Eine Kombination von in situ Hybridisierung und Immunocytochemie erlaubte die Charakterisierung der Expression von M6a im Hippocampus, Kleinhirn und im präfrontalen Cortex von „chronically restrained“ Ratten. Die in-situ Hybridisierung bestätigt, dass M6a sehr stark in den Pyramidalzellen und den Körnerzellen des Hippocampus, den Pyramidalzellen des Cortex und den Granularzellen des Kleinhirns exprimiert wird. Neuronen mit Interneuron-Morphologie zeigen keine Expression von M6a. Weiterhin deuten Ergebnisse der konfokale Lasermikroskopie darauf hin, dass das Glykoprotein M6a zu den präsynaptischen Endknöpfchen glutamaterger Neuronen transportiert wird, aufgrund einer Kolokalisierung der M6a Immunreaktivität mit Synaptophysin und vesikulärem Glutamat Transporter 1 (VGLUT1). Eine Kolokalisierung von M6a Immunoreaktivität mit MAP2 oder Expression in den Somata von Neuronen konnte nicht detektiert werden, was zeigt, dass M6a nicht in Dendriten lokalisiert ist. Im Hippocampus zeigte M6a eine punktartige Immunfärbung an verschiedenen Stellen der terminalen Bereiche von Granularzelle Mossfaser Axonen, welche durch Immunfärbung gegen das cytoplasmatische Calcium bindende Protein Calbindin verdeutlicht wurden. Analyse der Mossfaser Synapse, die die Granularzelle mit den Dendriten der CA3-Pyramidenzellen im hippocampalen stratum lucidum verbindet, zeigte, dass M6a vor allem mit der Plasmamembran der Axone und der Endknöpfchen, nicht aber mit den synaptischen Vesikeln assoziert ist. M6a und der vesikuläre GABA Transporter (VIAAT) wiesen eine überwiegend komplementäre Verteilung auf, was darauf hindeutet, dass M6a nicht in inhibitorischen Neuronen exprimiert wird und die Kolokalisierung nur beobachtet werden kann, wenn GABAerge Synapsen direkt neben glutamatergen Axonen zu liegen kommen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt von chronisch induzierten Stress in Ratten auf die M6a-Expression untersucht. Dabei wurden die Ratten 21 Tage chronisch in ihrer Bewegung eingeschränkt (chronic restraint). Es wurden Stress- Experimente durchgeführt, um die Expression von M6a mit i) Quantitativer Real-time PCR (RT-PCR) und ii) quantitativer in-situ Hybridisierung zu untersuchen. Die RT-PCR Ergebnisse zeigen, dass M6a in chronisch gestressten Ratten in verschiedenen Gehirnregionen unterschiedlich reguliert wird. Im Hippocampus dieser Ratten wird M6a signifikant herunter-, im präfrontalen Cortex dagegen nicht signifikant heraufreguliert. Im Cerebellum konne kein Effekt festgestellt werden. Der präfrontale Cortex besteht aus verschiedenen anatomischen und funktionalen Arealen, von denen nur einige auf Stress reagieren. Für RT-PCR-Versuche wurden Proben verwendet, die verschiedene Subregionen des präfrontalen Cortex enthielten, weshalb regionale Veränderungen der M6a Expression nicht festgestellt werden konnten. Aufgrund dieses Nachteils wurde eine quantitative in-situ Hybridisierung durchgeführt, um die stress-induzierten Veränderungen der M6a Expression in spezifischen neuronalen Zellpopulationen zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass M6a in den pyramidalen Neuronen der Schicht II/III im infralimischen und prälimbischen Cortex, jedoch nicht im anterioren Cortex signifikant heraufreguliert ist. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass das Glykoprotein M6a in den exzitatorischen Pyramidalzellen und Granularzelle exprimiert ist und dort in spezifischen Regionen der axonalen Plasmamembran lokalisiert ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass die stress-abhängige M6a Expression regional reguliert ist. Die regionalen Veränderungen der M6a Expression korrelieren mit den Regionen, die auch durch chronischen Stress induzierte Veränderungen in der neuronalen Morphologie zeigen. Die stress-induzierte Veränderung der M6a Expression könnte die strukturelle Integrität der Präsynapse beeinflussen und die neuroplastischen Mechanismen beeinträchtigen, die zum Schutz vor schädlichem Stress dienen.