Identification and Functional Characterization of unc5A during Neocortical Regionalization

Abstract

Im Laufe der Evolution der Wirbeltiere entwickelte insbesondere der Neokortex spezialisierte, das heißt funktionell sowie anatomisch unterschiedliche Areale zur Verarbeitung sensorischer Informationen, zum Lernen sowie zu komplexen Prozessen wie entscheidungsorientiertem Verhalten. Jedes dieser anatomisch unterschiedlichen Areale des Neokortex ist durch seine neuronalen Funktionen auf besondere Aufgaben spezialisiert. Darüber hinaus ist der Neokortex als übergeordnete Schaltstelle mit vielen anderen Bereichen des Gehirns vernetzt. Erst die Etablierung solcher komplexen neuronalen Netzwerke zwischen den verschiedenen Bereichen des Gehirns und somit den Stationen der Informationsaufnahme, -verarbeitung und weiterleitung ermöglicht den höheren Organismen die Bewältigung komplexer Aufgaben und die Entwicklung hoher kognitiver Fähigkeiten. Aus diesem Grund stellt die Untersuchung und Aufklärung der molekularen Mechanismen der Gehirnentwicklung die Grundlage für ein besseres Verständnis der funktionellen Eigenschaften und Kapazitäten des Gehirns dar. Zugleich können solche Untersuchungen Ansätze zur Erforschung der Pathogenese und molekulare Grundlagen genetisch bedingter Krankheiten und Syndrome liefern. Die zwei wichtigsten Prozesse während der Entwicklung der zellulären Architektur des Neokortex sind Regionalisierung und Laminierung. Nach einem aktuellen Modell der Kortexentwicklung, der so genannten Protomap-Hypothese (Rakic P., 1988), sind intrinsische genetische Mechanismen für die grundlegen destrukturelle Regionalisierung des Neokortex verantwortlich. Zum anderen scheint die Aufrechterhaltung und somit die spätere funktionelle Regionalisierung des Kortex von anderen Einflüssen, wie die Etablierung axonaler Kontakte von Neuronen aus dem Thalamus, abhängig zu sein (Protocortex-Modell, O’Leary DD., 1989). Die genauere Erforschung dieser Prozesse erfordert somit eine genaue funktionelle Analyse der Gene, die speziell für diese unterschiedlichen Entwicklungsphasen verantwortlich sind. Aus diesem Grund wurde mittels der DNA-Microarray-Technologie eine großtechnische Genexpressionsanalyse mit embryonalem neokortikalem Gewebe (E14.5) durchgeführt, die die Genexpression in verschiedenen Kortexarealen miteinander vergleicht. Da der Kortex erst nach dem embryonalen Entwicklungsstadium E14.5 von thalamischen Axonen innerviert wird, war es möglich, selektiv Gene zu identifizieren, die nach dem Protokortex-Modell potentiell für die frühe intrinsische Regionalisierung des Neokortex verantwortlich sind. Das zuvor unbekannte Gen unc5A wurde aus der Liste von 216 regionsspezifisch exprimierten Genen des Microarray-Datensatzes ausgewählt und auf seine mögliche Rolle während der Kortexentwicklung funktionell charakterisiert. Das unc5A-Gen kodiert einen Netrin-Rezeptor, der Chemorepulsion vermittelt und im Visuellen- und Piriformen-Kortex exprimiert ist, sowie in anderen Gehirnregionen, die für das Sehen und Riechen wichtig sind. Die durch Netrin vermittelten Systeme der Navigierung von Axonen sind während der Embryonalentwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) für die Zielfindung und Migration dieser Zellen wichtig. Aus diesem Grund wurde spekuliert, dass auch unc5A eine wichtige Rolle während der funktionellen und strukturellen Entwicklung neokortikaler Areale, insbesondere der Bereiche für das Sehen und Riechen, spielen könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, entwickelten und analysierten wir unc5A-Funktions-Verlust-Mutanten (loss-of function) sowie Funktions-Gewinn-Mutanten (gain-of function). Unc5A-Funktions-Verlust-Mutanten sind lebensfähig und pflanzen sich normal fort, manche Individuen sind jedoch blind. Diese Blindheit scheint vom genetischen Hintergrund der Tiere abhängig zu sein, da nur Tiere in einem 129 X CD1 Hintergrund, nicht jedoch Tiere in einem reinen 129 Hintergrund, betroffen sind. Unabhängig vom genetischen Hintergrund wurde in unc5A Mutanten keine erkennbare phänotypische Veränderung des Gehirns festgestellt. Um eine weitere effiziente und reproduzierbare Analyse des Phänotyps bezüglich der kortikalen Regionalisierung und Zielfindung von Axonen der kortikalen Kommissuren durchführen zu können, ist es deshalb nötig, die Mutanten auf einen reinen C57/BL6 Hintergrund zurückzukreuzen. Desweiteren wurden verschiedene transgene Mauslinien erstellt, die unc5A konditionell überexprimieren. Eine solche Überexpression von unc5A wurde zum einen in der distalen Neuroretina während der Embryonalentwicklung durchgeführt, um zu testen, ob dadurch die Entwicklung der örtlich festgelegten Projektion retinaler Axone in den Thalamus beeinträchtigt wird. Die Analyse zeigte, dass in transgenen Tieren unabhängig von der Überexpression Blindheit auftrat. Durch Rückkreuzung auf einen C57/BL6 Hintergrund konnte jedoch die überexpressions unabhängige Blindheit in transgenen Tieren überwunden werden. Interessanterweise erhöhte sich die Anzahl der überexpressions abhängigen blinden Individuen mit jedem Rückkreuzungsschritt. In Zukunft wird die Analyse der unc5A-Überexpression in einem reinen genetischen Hintergrund eine reproduzierbare Analyse der molekularen Grundlagen des Blindheit-Phänotyps und die möglichen Effekte auf die Entwicklung des Visuellen Kortex ermöglichen. Zusätzlich wurde unc5A in postmitoschischen und pyramidalen Neuronen des Neokortex überexprimiert. Diese transgenen Tiere stellen ein experimentelles Modell für die Untersuchung der kortikalen Areale dar, in denen Netrin-abhängige Mechanismen wichtig sind. Zusätzlich ermöglicht eine funktionelle Charakterisierung dieser transgenen Mäuse aufzuklären, ob sich das künstliche An- bzw. Ausschalten Netrin-abhängiger Mechanismen in Neuronen, die unc5A exprimieren, auf die Zielfindung ihrer Axone auswirkt. Da diese transgenen Tiere zudem lebens- und reproduktionsfähig sind, bieten sie ein gutes Modell zur weiteren Analyse des histologischen Phänotys sowie möglicher Verhaltensstörungen aufgrund möglicher Defekte der axonalen Navigation.