Expression and functional analysis of the germ cell specific genes ADAM 27 and Testase 2
Expressions- und Funktionsanalyse der Keimzell-specifischen Gene für ADAM 27 und Testase 2
by Ewelina Bolcun-Filas
Date of Examination:2004-01-21
Date of issue:2004-02-12
Advisor:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:PD Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
In the present study two members of the ADAM family of proteins, murine ADAM 27 and Testase 2, were characterized. Both genes are expressed specifically in the testicular germ cells and therefore are postulated to be involved in the spermatogenesis and/or fertilization events. ADAM 27 is a putative adhesion protein and presumed to be a ligand for integrin proteins, molecules which are located on egg membrane. ADAM 27 protein expression is detected as early as in spermatocyte stage of the spermatogenesis and initially it associates with Golgi bodies. Later on ADAM 27 protein is predominately localized in the cytoplasm. It is not clear whether the protein is removed from the mature sperm during differentiation or present on sperm surface or in/on acrosome, however ADAM 27 was detected in the epididymal sperm extracts. To elucidate the function of ADAM 27 and its role in the spermatogenesis, in vitro and in vivo approaches were undertaken. In vitro sperm-egg binding assays were performed with recombinant ADAM 27 proteins representing different functional domains of ADAM 27 (Disintegrin, Cys-rich, EGF- like). Our results suggest that ADAM 27 is more likely to interact with zona pellucida of egg via Cys-rich domain than through disintegrin domain or at very low level with oolemma. For functional analysis of ADAM 27 we disrupted ADAM 27 gene in mouse by homologuos recombination. We have generated knockout line in which the transmembrane domain of ADAM 27 was deleted. Both female and male mice homozygous for ADAM 27 mutated allele are fertile and we did not detect any obvious abnormalities in the reproductive tract, except a significant decrease in sperm motility in homozygous male mice. However, this does not affect the fertility of ADAM 27 mutant mice. We initiated a second knockout line which involved deletion of the first three exons of ADAM 27, including start codon of the gene, in order to disrupt the complete protein synthesis. We obtained four chimeras after the injection of recombinant ES cells into blastocyst, but we did not obtain any germ line transmission of the targeted allele in mice. Three out of four male chimeras appeared to be infertile and all of them were characterized by chimerism ratio higher than 70%. It is possible that infertility of these chimeras is due to disrupt ion of ADAM 27 locus, which would indicate haploinsufficient effect of ADAM 27 and therefore a crucial role of this protein in spermatogenesis. The second gene that has been investigated in the present study was Testase 2, also known as ADAM 25. Initially, Testase 2 was considered as a single copy gene in mouse genome. We found that the gene underwent duplication event during evolution, and now two very similar copies, Testase 2a and b, are present on mouse chromosome 8. We have observed that testase 2 a and b are transcribed simultaneously in mouse testis with first appearance in round spermatids. To elucidate the function of testase 2 we have started to generate knockout model lacking Testase 2 activity. We generated knockout construct which we found later to be specific for testase 2a copy. The few attempts we made to obtain recombinant clones with gene deletion were unsuccessful. When we found that there are in fact two genes, which possibly must be deleted to find out the function of testase 2 proteins, we stopped further trials to generate testase 2 mutant mice. Therefore other approaches must be undertaken to elucidate testase 2 function.
Keywords: ADAM family; Spermatogenesis; Knock out; Fertilization
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In den vorgelegten Arbeit wurden zwei
Mitglieder der ADAM-Familie, ADAM27 und Testase 2 der Maus,
untersucht. Beide Gene werden spezifisch in den testikulären
Keimzellen exprimiert und deswegen können diesen Gene eine Rolle in
der Spermatogenese und/oder beim Fertilisierungsprozess spielen.
ADAM 27 ist ein putatives Adhäsionsprotein, und es wird vermutet,
dass es an Integrine bindet, die Moleküle auf der
Ooocytenoberfläche sind. Die Expression von ADAM27 wurde erstmals
in den Spermatocyten detektiert. ADAM 27 findet sich zunächst im
Golgi-Apparat und später hauptsächlich im Cytoplasma. Es ist nicht
klar, ob das reife Protein während der Reifung der Spermien
entfernt wird oder im Akrosom gespeichert wird. Die ersten
Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass ADAM 27 im epididymalen
Spermienextrakt zu detektieren ist. Um die Funktion von ADAM 27 in
der Spermatogenese und beim Fertilisationsprozess aufzuklären,
wurden in vitro und in vivo Ansätze gewählt. Im in vitro Ansatz
wurde mithilfe von in vitro sythetisierten rekombinanten ADAM
27-Polypeptiden mit verschiedenen funktionellen Regionen
(Disintegrin, Cys-reich, EGF-like) die Rolle des Proteins bei der
Spermien-Oocyten Bindung untersucht. Die Ergebnisse aus diesen
Experimenten weisen darauf hin, dass ADAM 27 durch die Cys-reiche
Domäne an die Zona pellucida von Oocyten bindet. Für die
funktionellen Untersuchung von ADAM 27 in vivo, wurde zwei Knockout
Konstrukte hergestellt. Bei dem ersten Konstrukt wurde die
Transmembrandomäne deletiert. Die homozygoten mänlichen und
weiblichen Tiere sind fertil und zeigen keine Abnormalitäten ausser
einer reduzierten Spermienmotilität. Bei dem zweiten Konstrukt
wurden die ersten drei Exons (mit ATG) deletiert, um die Synthese
des gesamten Proteins zu verhindern. Keine der vier produzierten
Chimären zeigten Keimbahntransmission, was auf eine
Haploinsuffizienz hinweist. Drei von vier Chimären mit über 70%
Chimärismus waren infertil. Dies deutet darauf hin, dass ADAM 27
für eine normale Keimzellentwicklung von Bedeutung ist. Das zweite
untersuchte Gen war Testase 2, das auch als ADAM 25 bekannt ist. In
der Literatur wurde Testase 2 als single copy Gen identifiziert.
Unsere Untersuchungen haben aber gezeigt, dass es zwei Kopien des
Gens auf Chromosom 8 gibt. Es wurde festgestellt, dass die beiden
Gene im selben Spermatogenese-Stadium exprimiert werden. Aus diesem
Grund wurden die Experimente für die funktionelle Analyse von
Testase 2 in Knockout Mäusen eingestellt. Um die Funktion des
Testase 2 Gens aufzuklären, müssen andere Strategien entwickelt
werden, in denen die beiden Kopien dieses Gens ausgeschaltet
werden.
Schlagwörter: ADAM-Familie; Spermatogenese; Knockout; Fertilisierungsprozess; 570 Biowissenschaften; Biologie