Regulation of the anaphase promoting complex (APC/C) in the mitotic and meiotic cell cycle of Saccharomyces cerevisiae

Regulation des Anaphase promoting Komplex (APC/C) im mitotischen und meiotischen Zellzyklus von Saccharomyces cerevisiae

by Melanie Bolte
Doctoral thesis
Date of Examination:2004-01-22
Date of issue:2004-02-26
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Hans-Ulrich Mösch
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3456

 

 

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Abstract

English

Ubiquitin-dependent proteolysis is a crucial process in the eukaryotic cell cycle. A key player of this system is a large complex termed the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). The APC/C is an ubiquitin ligase, which is essential for the progression through mitosis. The APC/C ligates chains of ubiquitin molecules to lysine residues of its substrate proteins and thereby marks them for degradation by the 26S proteasome. The activity of the APC/C is precisely regulated during the cell cycle. The aim of this work was the characterisation of protein kinases involved in APC/C regulation in the mitotic and meiotic cell cycle of the yeast Saccharomyces cerevisiae. In the first part of this work, control of the APC/C by the protein kinase A (PKA) pathway was analysed. Glucose and activated Ras2 protein both induce PKA activity. Experimental data imply that these two signals are able to affect the APC/C synergistically. PKA of S. cerevisiae is encoded by three different genes, TPK1-3. This work revealed that all three genes have redundant functions in APC/C regulation. In the second part of this work, Ime2, a meiosis-specific protein kinase, was characterised. Ime2 was identified in a screen for negative regulators of the APC/C. Further experiments demonstrate, that Ime2 phosphorylates the APC/C regulator Cdh1 and thereby leads to inhibition of the APC/C. Ectopic expression of IME2 causes stabilisation of cyclins and other APC/C substrates. Furthermore IME2 expression in vegetative cells was shown to arrest cells in mitosis and to inhibit bud formation. These results suggest that Ime2 represents a meiosis-specific regulator of the APC/C. Finally, this work focused on the regulation of Ime2 stability. Ime2 protein levels were shown to fluctuate during meiosis. By the construction and analysis of an IME2 deletion set, the N-terminal region was identified as the part of the protein responsible for kinase activity, whereas the C-terminal 241 amino acids were shown to be essential for Ime2 instability. Smaller deletions did not show a distinct effect on stability of the resulting truncated proteins suggesting that two or more degradation signals are located in the C-terminal region. Deletions resulting in proteins with a truncated C-terminus led to a stabilised and active version of the kinase, which causes cells to form abnormal asci. This result indicates that the instability of Ime2 is important for proper progression through meiosis.
Keywords: cell cycle; anaphase promoting complex APC/C; mitosis; meiosis; Ime2; protein kinase A

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Die Ubiquitin-abhängige Proteolyse ist ein kritischer Prozess im eukaryontischen Zellzyklus. Ein Schlüsselfaktor dieses Systems ist der Anaphase-promoting Komplex/ Cyclosom (APC/C). Der APC/C ist eine Ubiquitinligase, die essentiell für den Ablauf der Mitose ist. Der APC/C ligiert Ketten von Ubiquitinmolekülen an die Lysinreste seiner Substrate, um diese Proteine für den Abbau durch das 26S Proteasom zu markieren. Die Aktivität des APC/C ist im Verlauf des Zellzyklus präzise reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Proteinkinasen, die in die Regulation des APC/C im mitotischen und meiotischen Zellzyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae involviert sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kontrolle des APC/C durch den Proteinkinase A (PKA)-Signalweg analysiert. Glucose und aktiviertes Ras2 Protein sind in der Lage die PKA zu aktivieren. Die experimentellen Daten zeigten, dass diese beiden Signale den APC/C synergistisch beeinflussen können. Die PKA von S. cerevisiae wird von drei verschiedenen Genen, TPK1-3, kodiert. Diese Arbeit offenbarte, dass diese drei Gene eine redundante Funktion in Bezug auf die Regulation des APC/C besitzten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die meiosespezifische Kinase Ime2 charakterisiert. Ime2 wurde bei der Suche nach negativen Regulatoren des APC/C identifiziert. Weitere Untersuchungen demonstrierten, dass Ime2 den APC/C-Regulator Cdh1 phosphorylieren kann und dadurch zur Inhibierung des APC/C führt. Ektopische Expression von IME2 verursacht die Stabilisierung von Cyclinen und weiteren APC/C Substraten. Außerdem führt die Expression von IME2 zu einem Zellzyklusarrest in der Mitose und verhindert die Sprossung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Ime2 ein meiosespezifischer Regulator des APC/C ist. Schließlich befasste sich diese Arbeit mit der Regulation der Stabilität des Ime2 Proteins. Während der Meiose schwankt die Ime2 Proteinmenge. Durch die Konstruktion und Analyse einer Reihe von IME2-Deletionen konnte die Kinaseaktivität von Ime2 der N-terminalen Region des Proteins zugeordnet werden, wohingegen den letzten 241 Aminosäuren am C-Terminus eine Funktion in der Proteininstabilität zukommt. Kleinere Deletionen zeigten keinen ausgeprägten Effekt auf die Stabilität. Dies legt die Vermutung nahe, dass in der C-terminalen Region mindestens zwei Degradationssignale vorhanden sind. Deletionen, die zu Proteinen mit verkürtztem C-Terminus führten, ergaben eine stabilisierten und aktiven Form der Kinase, die zur Bildung von ungewöhnlichen Asci führt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Instabilität von Ime2 wichtig für den korrekten Ablauf der Meiose ist.
Schlagwörter: Zellzyklus; Anaphase promoting Komplex APC/C; Mitose; Meiose; Ime2; Proteinkinase A; 570 Biowissenschaften; Biologie
 
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