Regulation of the anaphase promoting complex (APC/C) in the mitotic and meiotic cell cycle of Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Die Ubiquitin-abhängige Proteolyse ist ein kritischer Prozess im eukaryontischen Zellzyklus. Ein Schlüsselfaktor dieses Systems ist der Anaphase-promoting Komplex/ Cyclosom (APC/C). Der APC/C ist eine Ubiquitinligase, die essentiell für den Ablauf der Mitose ist. Der APC/C ligiert Ketten von Ubiquitinmolekülen an die Lysinreste seiner Substrate, um diese Proteine für den Abbau durch das 26S Proteasom zu markieren. Die Aktivität des APC/C ist im Verlauf des Zellzyklus präzise reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Proteinkinasen, die in die Regulation des APC/C im mitotischen und meiotischen Zellzyklus der Hefe Saccharomyces cerevisiae involviert sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kontrolle des APC/C durch den Proteinkinase A (PKA)-Signalweg analysiert. Glucose und aktiviertes Ras2 Protein sind in der Lage die PKA zu aktivieren. Die experimentellen Daten zeigten, dass diese beiden Signale den APC/C synergistisch beeinflussen können. Die PKA von S. cerevisiae wird von drei verschiedenen Genen, TPK1-3, kodiert. Diese Arbeit offenbarte, dass diese drei Gene eine redundante Funktion in Bezug auf die Regulation des APC/C besitzten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die meiosespezifische Kinase Ime2 charakterisiert. Ime2 wurde bei der Suche nach negativen Regulatoren des APC/C identifiziert. Weitere Untersuchungen demonstrierten, dass Ime2 den APC/C-Regulator Cdh1 phosphorylieren kann und dadurch zur Inhibierung des APC/C führt. Ektopische Expression von IME2 verursacht die Stabilisierung von Cyclinen und weiteren APC/C Substraten. Außerdem führt die Expression von IME2 zu einem Zellzyklusarrest in der Mitose und verhindert die Sprossung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Ime2 ein meiosespezifischer Regulator des APC/C ist. Schließlich befasste sich diese Arbeit mit der Regulation der Stabilität des Ime2 Proteins. Während der Meiose schwankt die Ime2 Proteinmenge. Durch die Konstruktion und Analyse einer Reihe von IME2-Deletionen konnte die Kinaseaktivität von Ime2 der N-terminalen Region des Proteins zugeordnet werden, wohingegen den letzten 241 Aminosäuren am C-Terminus eine Funktion in der Proteininstabilität zukommt. Kleinere Deletionen zeigten keinen ausgeprägten Effekt auf die Stabilität. Dies legt die Vermutung nahe, dass in der C-terminalen Region mindestens zwei Degradationssignale vorhanden sind. Deletionen, die zu Proteinen mit verkürtztem C-Terminus führten, ergaben eine stabilisierten und aktiven Form der Kinase, die zur Bildung von ungewöhnlichen Asci führt. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Instabilität von Ime2 wichtig für den korrekten Ablauf der Meiose ist.