Functional analysis of IGFBP-2 overexpression in mouse liver myofibroblasts: Therapeutic implication for liver fibrogenesis
Funktionelle Analyse der IGFBP-2 Ueberexpression in Lebermyofibroblasten bei Maeusen: Therapeutische Vorschlaege bei Liberfibrogenese
by Rajeswara Rao Pannem
Date of Examination:2007-10-30
Date of issue:2008-05-20
Advisor:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Detlef Doenecke
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Liver fibrosis is characterized by abnormal accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins which are secreted from the cells of the fibroblast lineage during chronic liver injury. Different liver cell populations are involved in this process: activated hepatic stellate cells (HSCs) as well as portal and perivascular liver myofibroblasts (LMFs) which represent morphologically and functionally different fibroblast populations. Several lines of evidence demonstrate that in contrast to LMFs, HSCs undergo spontaneous apoptosis both in vitro and in vivo, in parallel with their activation. Therefore, LMFs appear to be an essential cell type with fibrogenic potential in the liver. The IGF system including the insulin-like growth factors I and II (IGF-I, -II), their receptors (IGF-I receptor, IGF-IR; IGF-II/mannose 6-phosphate receptor, IGF-II/M6-PR) and six high affinity IGF binding proteins (IGFBPs) participate in the regulation of growth and differentiation of cells of the fibroblast lineage, possibly contributing to the fibrogenic process. Significantly increased levels of IGFBP-2 in sera and hepatic tissue from patience suffering from liver cirrhosis of different etiology (Holt et al., 1996; Holt et al., 1997; Kratzsch et al., 1995; Ross et al., 1996; Wolf et al., 2000; Moller et al., 1995; Scharf et al., 1996). In general, IGFBP-2 has been shown either to inhibit or to enhance the effects of IGF-I in certain cell types studied. However, the precise role of IGFBP-2 overexpression in liver fibrogenesis is unknown. The aim of the present work is to examine the relationship between IGFBP-2 overexpression and cellular functions of LMFs. For this purpose, LMFs were isolated from the livers of wild type (wt) and CMV-IGFBP-2 transgenic (IGFBP-2 (+/-)) mice. IGFBP-2 (+/-) mLMFs showed an approximately four to five-fold increased expression of IGFBP-2 mRNA as compared with wt mLMFs during different time points of culture (days 2 to 5) that was confirmed at protein level by [125I]-IGF-I ligand. In wt mLMFs, the expression of IGFBP-3 mRNA was low at day 2 of culture but high at day 5 of culture whereas IGFBP-3 mRNA expression was reversibly decreased from high levels at day 2 of culture to low levels at day 5 of culture in IGFBP-2 (+/-) mLMFs. The expression of IGF-I, IGF-IR and IGF-II/M6-PR mRNA was increased in IGFBP-2 (+/-) mLMFs compared with wt mLMFs. In wt mLMFs, addition of IGF-I dose-dependently reduced IGFBP-2 mRNA and protein levels whereas in IGFBP-2 (+/-) mLMFs IGF-I showed a stimulatory effect on IGFBP-2 mRNA and protein levels. The IGF-I-dependent stimulation of IGFBP-3 mRNA and protein levels in IGFBP-2 (+/-) mLMFs were less pronounced than in wt LMFs. In contrast, the IGF-I-dependent decrease of IGF-IR mRNA and protein levels were not significantly different in wt and IGFBP-2 (+/-) mLMFs. Functionally, IGF-I dose-dependently stimulated DNA synthesis in wt mLMFs whereas in IGFBP-2 (+/-) mLMFs IGF-I-induced DNA synthesis was abrogated compared to untreated controls. Similarly, in wt LMFs, IGF-I stimulated mRNA expression of fibulin-2 and fibronectin 1, two of the ECM proteins deposited during liver fibrosis whereas IGF-I-induced mRNA expression of fibulin-2 and fibronectin 1 was inhibited compared to untreated controls in IGFBP-2 (+/-) mLMFs. Together, the data of present study demonstrate that overexpression of IGFBP-2 in LMFs is associated with alterations of DNA synthesis and of biosynthesis of ECM components in these cells. Our data point to a regulatory role of IGFBP-2 overexpression during liver fibrogenesis and indicate IGFBP-2 as a potential target in antifibrotic therapy.
Keywords: Liver fibrogenesis; liver myofibroblasts; IGFBP-2 overexpression; DNA synthesis; extracellular matrix synthesis
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Leberfibrose ist durch eine abnormale
Akkumulation von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM)
charakterisiert, die von Zellen der Fibroblastenlinie während
chronischer Leberverletzungen sekretiert werden. Verschiedene
Zellpopulationen der Leber sind an diesem Prozess beteiligt:
aktivierte hepatische Sternzellen (HSCs) ebenso wie portale und
perivaskuläre Lebermyofibroblasten (LMFs), die morphologisch und
funktional verschiedene Fibroblastenpopulationen repräsentieren.
Durch verschiedene Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass HSCs,
im Gegensatz zu LMFs, sowohl in vivo als auch in vitro spontane
Apoptose durchlaufen, was parallel zu ihrer Aktivierung geschieht.
Daher scheinen LMFs ein zentraler Zelltyp mit fibrinogener
Aktivität in der Leber zu sein. Das IGF-System beinhaltet die
Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF-I, -II), ihre
Rezeptoren (IGF-I-Rezeptor, IGF-IR;
IGF-II/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor, IGF-II/M6-PR) und sechs
hochaffine IGF bindende Proteine (IGFBPs) und ist an der Regulation
von Wachstum und Differenzierung von Zellen der Fibroblastenlinie
beteiligt, wobei es wahrscheinlich an der Fibrinogenese beteiligt
ist. Deutlich erhöhte Level an IGFBP-2 in Serum und hepatischem
Gewebe wurde bei Patienten, die an Leberzirrhose verschiedener
Ätiologie leiden, gefunden (Holt et al., 1996; Holt et al., 1997;
Kratzsch et al., 1995; Ross et al., 1996; Wolf et al., 2000; Moller
et al., 1995; Scharf et al., 1996). Im Allgemeinen wurde gezeigt,
dass IGFBP-2 entweder die Auswirkungen von IGF-I in bestimmten
Zelltypen inhibiert oder verstärkt. Allerdings ist die genaue Rolle
von IGFBP-2-Überexpression in der hepatischen Fibrinogenese
unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist, das Verhältnis von
IGFBP-2-Überexpression und den zellulären Funktionen der LMFs zu
untersuchen. Dazu wurden LMFs aus der Leber von Wildtyp- (wt) und
CMV-IGFBP-2-transgenen Mäusen isoliert. IGFBP-2 (+/-) mLMFs zeigten
eine etwa vier- bis fünffach höhere Expression an IGFBP-2 mRNA als
wt mLMFs zu verschiedenen Zeitpunkten der Zellkultivierung (Tag 2
bis Tag 5). Dies wurde auch auf dem Proteinlevel mittels
[125I]-IGF-I Ligandenblot bestätigt. In wt LMFs war die Expression
von IGFBP-3 mRNA nach zwei Tagen Kultur niedrig, aber erhöht nach
fünf Tagen; wohingegen die IGFBP-3 mRNA-Expression in IGFBP-2 (+/-)
mLMFs von erhöhten Leveln nach zwei Tagen Kultur auf niedrige Level
nach fünf Tagen Kultur absank. Die Expression von IGF-I, IGF-IR und
IGF-II/M6-PR mRNA war in IGFBP-2 (+/-) mLMFs erhöht. In wt mLMFs
reduzierte die Zugabe von IGF-I die mRNA- und Proteinlevel,
wohingegen IGF-I in IGFBP-2 (+/-) mLMFs einen stimulierenden Effekt
auf die mRNA- und Proteinlevel besitzt. Die IGF-I-abhängige
Stimulation der IGFBP-3 mRNA- und Proteinlevel in IGFBP-2 mLMFs war
weniger ausgeprägt als in wt LMFs. Im Gegensatz dazu war das
IGF-I-abhängige Absinken der mRNA- und Proteinlevel in wt- und
IGFBP-2 (+/-) LMFs nicht signifikant unterschiedlich. IGF-I
stimulierte in Dosis-abhängiger Weise die DNA-Synthese in wt-mLMFs,
wohingegen in IGFBP-2 (+/-) mLMFs die IGF-I-induzierte DNA-Synthese
geringer war als in der unbehandelten Kontrolle. In ähnlicher Weise
stimulierte IGF-I in wt-mLMFs die mRNA-Expression von Fibulin-2 und
Fibronectin 1, bei denen es sich um extrazelluläre Matrix-Proteine
handelt, die während der Leberfibrose dort abgelegt werden,
wohingegen die IGF-I-induzierte mRNA-Expression von Fibulin-2 und
Fibronectin 1 in IGFBP-2 (+/-) mLMFs im Vergleich zu unbehandelten
Kontrollen reduziert war. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass
die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Überexpression von IGFBP-2
in LMFs mit Veränderungen in der DNA-Synthese und der Biosynthese
von ECM-Komponenten in diesen Zellen einhergeht. Unsere Daten
weisen auf eine regulatorische Funktion der IGFBP-2-Überexpression
während der hepatischen Fibrinogenese hin und präsentieren IGFBP-2
als potentielles Ziel in der antifibrotischen Therapie.
Schlagwörter: Leberfibrogenese; Lebermyofibroblasten; IGFBP-2 Ueberexpresssion; DNA-Synthese; Extrazellulaeren Matrix Synthese