Conformational state of monomeric kinesin UNC-104

Abstract

Der sich anterograd fortbewegende kinesin-3 Motor UNC-104 ist esenziell für den Transport von synaptishen Vesikeln in neuronen. in vitro ist UNC-104 nicht protzessiv und zeigt ein Bewegungsmuster, das am ehesten als gerichtete Diffusion zu beschreiben ist. Andererseits zeigt kinesin UNC-104 in vivo aktiven und schnellen Transport seines Cargos . Dieses Verhalten führ zur H-ypothese, dass der eigentlich monomere kinesin Motor in vivo nicht als einzelner und monomerer Motor in Erscheinung tritt, sondern möglicherweise dimerisiert, sobald er an sein Cargo bindet. Die Konformation des Motors in vivo während des aktiven Tranports wird aktuellen in unserem Forschungsfeld diskutiert. Die in dieser Arbeit vorgenommenen in vivo und in vitro Experimente führen zum Schluß, dass Kinesin UNC-104 wirklich in vivo, in den Neuronen lebender Organismen, als Dimer vorkommen kann. Vorherige in vitro Experimente legten nahe, dass die neck coiled-coil Region diejenige sein könnte, in der die Dimerisierung stattfindet (Tomishige et al., 2002, Klopfenstein et al., 2002). Um die Rolle der coiled-coil Motive in diesem Prozess zu ermitteln wurden Punktmutationen in diesem Bereich manifestiert, die entweder die Möglchkeit der Formierung einer coiled-coil Struktur fördern, oder deren Bildung entgegenwirken. Die mutierten Proteine wurden in voller Länge in neuronen von C. elegans expremiert. Identisch mutierte, aber verkürzten Proteine wurden aufgereinigt und in in vitro Assays getestet. Einzig allein Motoren, deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung erhöht ist, waren in vivo fähig die hohen Geschwindigkeiten während der Transportprozesse im Neuron zu erreichen. Die Proteine, deren Fähigkeit zur Bildung der coiled-coil Struktur beeinträchtigt ist konnten diese hohen Geschwindigkeiten nicht erreichen. Darüber hinaus zeigten die Mutanten, die Proteine in sich trugen, deren Fähigkeit zur Bildung der coiled-coil Struktur beeinträchtigt ist; Probleme bei der Muskelkontraktion. Die Präsenz der Dimere in vivo wurde durch ein in dieser Arbeit entwickelten System nachgewiesen, das Fluoreszenz Anisotropie und Spinning Disc konfokale Laser Mikroskopie verbindet. Es zeigte sich, dass sich die Punktmutanten des Proteins deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung erhöht ist eher zu Dimeren zusammenschließen als die unveränderten Proteine. Umgekehrt konnte gezeigt warden, dass Punktmutanten des Proteins, deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung verringert ist, weniger zu Dimeren neigen als die unveränderten Proteine. Die in vivo Studien werden durch die Ergenisse unserer in vitro Experimente unterstützt, die auf Einzelmolekül-Messungen beruhen. Sie zeigen den identischen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Bildung einer coiled-coil Struktur und dem Erreichen für den Organismus lebenswichtigen hohen Geschwindigkeit der Transportproteine und das obwohl deren Michalelis-Menten Kinetik in in vitro multi-motor gliding Assays nicht unterschiedlich. Der direkte Nachweis einer Interaktion zum Dimer konnte sowohl beim unveränderten Protein, als auch bei den Proteinen des Proteins deren Fähigkeit zur coiled-coil Bildung erhöht ist, durch cross linking erbracht werden. Die Experimente zeigen eindeutig, dass kinesin-3 in vivo als Dimer vorliegen kann und zeigen zusätzlich einen direkten Zusammenhang zwischen dem Dimerisierungsstatus und den Tansportgeschwindigkeiten des Proteins.