Untersuchungen zur Funktion der Gene MPH1 und MMS2 aus Saccharomyces cerevisiae bei der fehlerfreien Umgehung von replikationsarretierenden DNA-Schäden

Abstract

Die Umgehung von replikationsarretierenden DNA-Schäden läuft in vivo mindestens über zwei Prozesse: homologe Rekombination durch Schwesterchromatid-Interaktion (SCI) und Postreplikative Reparatur (PRR). Die PRR wird zusätzlich in einen fehlerfreien und einen fehlerbehafteten Weg unterteilt. Für homologe Rekombination sind vor allem die Proteine Rad51 und Rad52 notwendig. Die fehlerbehaftete PRR erfolgt über Rev3- und Rad30-abhängige Transläsionssynthese. Der Mechanismus der fehlerfreien PRR ist dagegen noch weitgehend unklar. Bekannt ist jedoch, dass die fehlerfreien Prozesse über Polyubiquitinierung des PCNA am Lysin 164 durch das Heterodimer Mms2/Ubc13 und Rad5 stimuliert werden. Die Polyubiquitinierung erfolgt über das Ubiquitin-interne Lysin 63. Nach bisheriger etablierter Lehrmeinung gelten die fehlerfreie Postreplikative Reparatur und homologe Rekombination als zwei voneinander unabhängige und alternativ einsetzbare Prozesse. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zeigen dagegen, dass es sich bei der fehlerfreien PRR nicht um HR-unabhängige Prozesse handeln kann: o rad51 ist epistatisch zu mms2 in Bezug auf die Sensitivität gegen 4 NQO. o rad51 ist epistatisch zu mms2 in Bezug auf die spontanen Mutationsraten. o Wie in rad51-Mutanten ist die Rate spontaner Schwesterchromatid-Interaktionen in mms2-Mutanten ist leicht erhöht. o Die Frequenz 4 NQO-induzierter Schwesterchromatid-Interaktionen ist in mms2- sowie in ubc13-Mutanten stark reduziert. o Der ubc13-Phänotyp ist komplementierbar und von der katalytischen Funktion des Ubc13-Proteins abhängig. o Die Mutation des Ubiquitin-internen Lysin 63 führt zu einem mit ubc13 vergleichbaren Phänotyp. o Die Mutation des Substrats (PCNA-K164R) führt zu einem ähnlichen Phänotyp wie in mms2 und ubc13 und ist epistatisch zu ubc13 in Bezug auf die Sensitivität gegen 4 NQO. Die Schwesterchromatid-Interaktionen wurden im Rahmen dieser Arbeit mit einem System gemessen, welches neu in der Arbeitsgruppe von Dr. W. Kramer entwickelt wurde. Es beruht auf der Messung einer G418-Resistenz als Folge der Reversion einer direkten Sequenzwiederholung. Anhand der in dieser Arbeit dargelegten Daten lässt sich zeigen, dass die mit diesem System gemessenen Ereignisse strikt von der homologen Rekombination abhängig sind: o rad52-Mutanten weisen weder spontane noch 4-NQO-induzierte Reversions-ereignisse auf. o rad51-Mutanten weisen stark reduzierte 4 NQO-induzierte Reversionsfrequenzen auf. o Die spontane Reversionsrate in rad51 ist erhöht, was vermutlich auf eine Anhäufung von SSA- gegenüber SDSA- bzw. DSBR-Ereignissen zurückzuführen ist. Durch genetische Interaktionsstudien zwischen rad30, rev3, rad51 und mms2 konnten Evidenzen gefunden werden, welche es wahrscheinlich machen, dass die Polyubiquitinierung auch Rev3-abhängige Mechanismen stimuliert und einen Einfluss auf zusätzliche Prozesse hat: o rad51 und rev3 sind synergistisch bei der Sensitivität gegen MMS. Die zusätzliche Deletion von mms2 hat jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Sensitivität. o rad51rad30 und mms2 sind additiv bis synergistisch bei der Sensitivität gegen UV-Strahlung. mms2 und rad51rev3 sind dagegen nur subadditiv. Für die Funktion von Mms2/Ubc13 wurden anhand dieser Daten als wahrscheinlichstes Modell eine Stimulation der Rev3-abhängigen Prozesse sowie der homologen Rekombination durch direkte Interaktion zwischen ubiquitiniertem PCNA und den beteiligten Proteinen vorgeschlagen. Für Mph1, welches an der HR-abhängigen fehlerfreie Umgehung von replikationsarre-tierenden DNA-Schäden beteiligt ist, konnten die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zeigen, das die kürzlich in der Literatur beschriebene Auflösung eines D-Loops nicht die einzige Funktion des Proteins sein kann: o mph1 weist eine Reduktion der Camptothecin-, MMS- und 4-NQO-induzierten Reversionsfrequenzen auf, wobei die Reduktion bei 4-NQO am deutlichsten ist. o mph1 weist eine zu rad51 vergleichbare Erhöhung der spontanen Reversionsrate auf. o mph1 weist kaum eine Reduktion der 4-NQO-induzierten Reversionsfrequenzen im his3-5"/his3-3"-Modul (Fasullo & Davis, 1987, Proc Natl Acad Sci USA, 84, 6215-6219) auf, welches vermutlich hauptsächlich cross over-Ereignisse detektiert.