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Adhesion of the rapeseed pathogen Verticillium longisporum to its host Brassica napus: Uncovering adhesion genes and the evolutionary origin of the fungus

Die Adhäsion der Raps Erreger Verticillium longisporum seinen Wirt Brassica napus: Aufdeckung Adhäsion Genen und der evolutionären Ursprung des Pilzes

by Van Tuan Tran
Doctoral thesis
Date of Examination:2011-05-02
Date of issue:2011-05-06
Advisor:Dr. Susanna Braus-Stromeyer
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Referee:PD Dr. Stefan Irniger
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3539

 

 

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Abstract

English

Verticillium longisporum, a soil-borne plant pathogen, is an emerging problem for oilseed rape and other crucifers. The mechanism of infection through plant roots and the evolutionary origin of this fungus are still not known. Twenty four different cDNA sequences of V. longisporum involved in adhesion were characterized using a yeast screening system. These candidate sequences encode proteins of four groups including regulatory proteins, cell wall and membrane proteins, proteins of transport and metabolism, and hypothetical proteins with unknown functions. Two of the regulatory proteins named VTA1 and VTA2 could activate the expression of yeast FLO1 adhesin known to promote cell-cell adhesion (flocculation) and adhesion of yeast to different surfaces. These regulators might also control the expression of homologues of FLO1 in Vertillium species. Two high-throughput systems, one for gene silencing in V. longisporum and the other for gene disruption in V. dahliae have been developed. The silencing system with gateway technology requires less time for generating the silencing constructs. The silencing efficiency of VTA2 gene could reach 80-90% in V. longisporum. VTA2 gene could be co-silenced together with the red fluorescent protein gene in order to speed up the screening for the best silenced mutants. In addition, with a new gene disruption system, the gene for VTA2 in V. dahliae could be knocked-out in 45-76% transformants. The VTA2 deletion mutant of V. dahliae lost its ability to produce conidia. The surface hydrophobicity of the mutant was completely altered and aerial mycelium formation was markedly reduced. Moreover, this mutant was sensitive to oxidative stress and less virulent on plants. Sequencing of VTA1 and VTA2 together with rDNA and two velvet genes revealed the evolutionary origin of V. longisporum. This rapeseed pathogen is an interspecies hybrid between V. dahliae and V. albo-atrum at the dawn of species formation. Characteristic single nucleotide polymorphisms suggest a single initial hybridization event. A further step of speciation is homogenization of repetitive rDNA clusters. Homogenization happened at least twice and caused confusion in taxonomy, because both rDNA types can still be isolated from nature corresponding either to V. albo-atrum or V. dahliae.
Keywords: Verticillium longisporum; adhesion; rapeseed; regulators; adhesins; knock-out; silencing; evolutionary origin; hybrid; plant pathogens

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Verticillium longisporum, ein im Boden lebendes Pflanzenpathogen, stellt ein wachsendes Problem für Raps und andere Kreuzblütler dar. Der Infektionsmechanismus über die Pflanzenwurzel sowie der evolutionäre Ursprung dieses Pilzes sind noch weitgehend unbekannt. In einem Hefe-Screening konnten 24 verschiedene cDNA Sequenzen von V. longisporum identifiziert werden, die potentiellen an der Adhäsion beteiligten sein könnten. Die Sequenzen konnten in vier Gruppen unterteilt werden: Regulatorische Proteine, Zellwand- und Membranproteine, Transport und Stoffwechselproteine, sowie konservierte Proteine mit unbekannter Funktion. Zwei der regulatorischen Proteine VTA1 und VTA2 aktivierten die Expression des Adhäsins FLO1 in Hefe, welches für die Zell-Zell-Adhäsion (Flokkulation) und Adhäsion von Hefe auf verschiedenen Oberflächen verantwortlich ist. Diese potentiellen Regulatoren sind möglicherweise auch in der Lage die Expression von FLO1 Homologen in Verticillium zu kontrollieren. Es wurden zwei Systeme für die Erstellung von Knock-downs und Knock-outs in V. longisporum und V. dahliae entwickelt. Mit dem neuen System für Gen-“silencing“ konnte mittels der “gateway“ Technologie die Zeit für das Erstellen von Konstrukten verkürzt werden und eine “silencing“ Effizienz von 80-90 % für das Gen VTA2 erreicht werden. VTA2 konnte zusammen mit einem rot fluoreszierenden Protein co-“gesilenced“ werden. Dadurch konnte die Suche nach Mutanten mit der höchsten “silencing“ Effizienz verbessert und verkürzt werden. Zudem konnte in V. dahliae das Gen VTA2 mit dem Gen-Deletionssystem in 45-76 % der Transformanten deletiert werden. Eine Deletion von VTA2 in V. dahliae führt zu einem Verlust der Konidienbildung, die Oberflächenhydrophobizität und die Bildung von Luftmyzel waren stark verändert. Ebenso war die Mutante sensitiv für oxidativen Stress und die Virulenz in planta war reduziert. Die Sequenzierung der Gene VTA1, VTA2, der Gene für rDNA und zwei Velvet-Gene legten den evolutionären Ursprung von V. longisporum offen. Dieser Rapsschädling ist ein Hybrid aus V. dahliae und V. albo-atrum. Charakteristische Einzelnukleotid-Polymorphismen lassen vermuten, dass es sich um ein einzelnes initiales Hybridisierungsereignis handelt. Ein weiterer Schritt der Artbildung ist die Homogenisierung der repetitiven rDNA-Cluster. Diese Homogenisierung hat mindestens zweimal stattgefunden und zu erheblicher Verwirrung in der Taxonomie geführt, weil beide rDNA Typen aus V. longisporum isoliert werden können und die Stämme dann entweder V. dahliae oder V. albo-atrum zugeordnet werden können.
Schlagwörter: Verticillium longisporum; Adhäsion; Raps; Regulatoren; Adhäsine; Knock-out; Silencing; evolutionären Ursprung; Hybrid; Pflanzenpathogen; Verticillium longisporum, Adhäsion; Raps; Regulatoren, Adhäsine, Knock-out, Silencing, evolutionären Ursprung, Hybrid, Pflanzenpathogen
 

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