Molecular profiling of presynaptic docking sites
Molekulare Zusammensetzung präsynaptischer Dockingstellen
by Anne Janina Boyken
Date of Examination:2011-07-04
Date of issue:2011-10-20
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Referee:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
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Abstract
English
In presynaptic nerve endings, exocytosis of synaptic vesicles is restricted to specialized areas of the plasma membrane, called active zones, that are distinguished by electron-dense material. Here synaptic vesicles attach to the release sites (docking) and are then activated (priming) before undergoing calcium-dependent exocytosis, releasing their neurotransmitter content into the synaptic cleft. Many of the key players of the presynaptic exocytotic machinery are known, and also the major scaffold proteins of the active zone have been identified. However, the precise molecular composition of the sites at which vesicles dock remains to be elucidated. Proteomic approaches to identify protein components of these sites are challenging because of difficulties in purifying these sites. Most importantly it has been very difficult to separate presynaptic membranes from postsynaptic membranes and the postsynaptic protein scaffold. Here we report about a new procedure allowing for an almost quantitative separation of pre- and postsynaptic membrane fractions. The procedure involves mild proteolysis resulting in the cleavage of the adhesion molecules connecting pre- and postsynaptic membranes, followed by gradient centrifugation, lysis of the presynaptic compartment, separation of free and docked vesicles, and immunoisolation using antibodies specific for synaptic vesicle proteins as the final purification step. Using quantitative proteomics we then compared the protein composition of free and docked vesicles. In the latter fraction we detected all major active zone proteins. In addition we identified many ion channels and transporters, cell adhesion molecules and plasma membrane-specific signaling proteins that have been reported to be involved in synaptic transmission. Only very few postsynaptic proteins or proteins derived from other organelles (except of mitochondria) were detected. The docked vesicle fraction contained more than 30 previously uncharacterized proteins, many of which are predicted to contain single or multiple transmembrane domains. Preliminary characterization of one of the new membrane proteins using a newly generated antibody revealed specific localization to presynaptic nerve terminals, raising the possibility that the protein is involved in presynaptic function. Additionally, this new procedure was used to quantify changes in the presynaptic proteome as a result of effector treatment. The Rab effector GDI efficiently removed Rab proteins from the docked vesicle fraction, but no other significant changes were observed among the remaining 500 identified proteins in the docked vesicle fraction.
Keywords: synaptic transmission; synapse; active zone; docking; synaptic vesicles
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Exozytose in präsynaptischen Nervenenden findet unter präziser zeitlicher und räumlicher Kontrolle statt. Synaptische Vesikel docken und fusionieren an speziellen Stellen an der Plasmamembran, sogenannten „aktiven Zonen“, die sich durch ein ausgeprägtes Protein-Netzwerk auszeichnen. Einige der beteiligten Proteine wurden bereits identifiziert und charakterisiert, allerdings ist die genaue molekulare Zusammensetzung dieser docking sites noch nicht geklärt. Proteomische Analysen dieser Fraktionen sind aufgrund der schwierigen biochemischen Isolierbarkeit, insbesondere der Abtrennung der aktiven Zone von der postsynaptischen Membran und der postsynaptischen Dichte, limitiert. In dieser Arbeit wird eine neue Methode eingeführt, die eine nahezu quantitative Trennung von prä- und postsynaptischen Membranfraktionen erlaubt. Die hier gezeigte Methode basiert auf einer milden Proteolyse von Synaptosomen, wodurch die extrazellulären Domänen der trans-synaptischen Adhäsionsmoleküle abgebaut werden und so die Verbindung zwischen den Membrankompartimenten aufgehoben wird. Im Anschluss an den proteolytischen Verdau werden die Synaptsomen durch osmotischen Schock lysiert und die einzelnen Komponenten (präsynaptische Plasmamembran mit gedockten Vesikeln, postsynaptische Dichte, freie Vesikel) durch Zentrifugation in einem Dichtegradienten separiert. Mit Antikörpern gerichtet gegen das Vesikelprotein Synaptophysin wurden beide Vesikelpopulationen (gedockte und freie Vesikel) separat voneinander aus dem Dichtegradient immunoisoliert. Die beiden Vesikelfraktionen wurden unter Verwendung quantitativer Massenspektrometrie miteinander verglichen. Neben allen wichtigen Vesikelproteinen, die in beiden Fraktionen im gleichen Verhältnis vorhanden waren, konnten in der gedockten Vesikelfraktion zusätzlich fast alle bekannten Proteine der aktiven Zone identifiziert und angereichert werden. Darüber hinaus enthielt die gedockte Vesikel Fraktion viele Ionenkanäle und Transporter der Plasmamembran, Adhäsionsmoleküle sowie weitere Proteine, die an der synaptischen Transmission beteiligt sind. Bemerkenswerterweise wurden nur sehr wenige postsynaptische Proteine oder Proteine anderer Organellen (mit Ausnahme von Mitochondrien) detektiert, was die Spezifität der Methode bestärkt. Besondere Aufmerksamkeit gelten den mehr als 30 neuen, bisher uncharakterisierten Proteinen, die in der gedockten Vesikelfraktion identifiziert werden konnten und von denen eines (JB1) näher untersucht wurde. Unter Verwendung eines neu generierten Antikörpers konnte eine präsynaptische Lokalisation von JB1 bestätigt werden. Zusätzlich zur Identifizierung von Proteinen kann die hier angewandte Methode auch verwendet werden um Veränderungen im präsynaptischen Proteom durch Effektoren zu quantifizieren. Inkubation der gedockten Vesikelfraktion mit dem Rab Effektor GDI führte zu einer signifikanten Reduktion der Rab-Proteine, die übrigen identifizierten Proteine in der gedockten Vesikelfraktion wiesen keine quantitiven Veränderungen auf.
Schlagwörter: Synapse; Axon; aktive Zone; Docking; Synaptische Vesikel