Molecular profiling of presynaptic docking sites

Abstract

Exozytose in präsynaptischen Nervenenden findet unter präziser zeitlicher und räumlicher Kontrolle statt. Synaptische Vesikel docken und fusionieren an speziellen Stellen an der Plasmamembran, sogenannten „aktiven Zonen“, die sich durch ein ausgeprägtes Protein-Netzwerk auszeichnen. Einige der beteiligten Proteine wurden bereits identifiziert und charakterisiert, allerdings ist die genaue molekulare Zusammensetzung dieser docking sites noch nicht geklärt. Proteomische Analysen dieser Fraktionen sind aufgrund der schwierigen biochemischen Isolierbarkeit, insbesondere der Abtrennung der aktiven Zone von der postsynaptischen Membran und der postsynaptischen Dichte, limitiert. In dieser Arbeit wird eine neue Methode eingeführt, die eine nahezu quantitative Trennung von prä- und postsynaptischen Membranfraktionen erlaubt. Die hier gezeigte Methode basiert auf einer milden Proteolyse von Synaptosomen, wodurch die extrazellulären Domänen der trans-synaptischen Adhäsionsmoleküle abgebaut werden und so die Verbindung zwischen den Membrankompartimenten aufgehoben wird. Im Anschluss an den proteolytischen Verdau werden die Synaptsomen durch osmotischen Schock lysiert und die einzelnen Komponenten (präsynaptische Plasmamembran mit gedockten Vesikeln, postsynaptische Dichte, freie Vesikel) durch Zentrifugation in einem Dichtegradienten separiert. Mit Antikörpern gerichtet gegen das Vesikelprotein Synaptophysin wurden beide Vesikelpopulationen (gedockte und freie Vesikel) separat voneinander aus dem Dichtegradient immunoisoliert. Die beiden Vesikelfraktionen wurden unter Verwendung quantitativer Massenspektrometrie miteinander verglichen. Neben allen wichtigen Vesikelproteinen, die in beiden Fraktionen im gleichen Verhältnis vorhanden waren, konnten in der gedockten Vesikelfraktion zusätzlich fast alle bekannten Proteine der aktiven Zone identifiziert und angereichert werden. Darüber hinaus enthielt die gedockte Vesikel Fraktion viele Ionenkanäle und Transporter der Plasmamembran, Adhäsionsmoleküle sowie weitere Proteine, die an der synaptischen Transmission beteiligt sind. Bemerkenswerterweise wurden nur sehr wenige postsynaptische Proteine oder Proteine anderer Organellen (mit Ausnahme von Mitochondrien) detektiert, was die Spezifität der Methode bestärkt. Besondere Aufmerksamkeit gelten den mehr als 30 neuen, bisher uncharakterisierten Proteinen, die in der gedockten Vesikelfraktion identifiziert werden konnten und von denen eines (JB1) näher untersucht wurde. Unter Verwendung eines neu generierten Antikörpers konnte eine präsynaptische Lokalisation von JB1 bestätigt werden. Zusätzlich zur Identifizierung von Proteinen kann die hier angewandte Methode auch verwendet werden um Veränderungen im präsynaptischen Proteom durch Effektoren zu quantifizieren. Inkubation der gedockten Vesikelfraktion mit dem Rab Effektor GDI führte zu einer signifikanten Reduktion der Rab-Proteine, die übrigen identifizierten Proteine in der gedockten Vesikelfraktion wiesen keine quantitiven Veränderungen auf.