Genetic disruption of the master pacemaker in the suprachiasmatic nucleus sheds light on the hierarchical organization of the mammalian circadian timing system
Genetische Manipulation des zentralen Schrittmachers im suprachiasmatischen Nucleus
by Jana Husse
Date of Examination:2011-11-14
Date of issue:2011-11-30
Advisor:Prof. Dr. Gregor Eichele
Referee:Prof. Dr. Gregor Eichele
Referee:Prof. Dr. Erik Maronde
Files in this item
Name:husse.pdf
Size:4.72Mb
Format:PDF
Abstract
English
Circadian timing systems evolved in most organisms to adapt to the daily alternation of light and dark and the accompanying changes of environmental parameters such as food availability and predator occurrence. Circadian clocks allow organisms to anticipate these changes, which in turn increases their evolutionary fitness. The first part of this thesis describes the generation and validation of a new genetic mouse model of central clock disruption. It is assumed, that the mammalian circadian timing system is hierarchically organized with a master pacemaker in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus and subordinated clocks in peripheral tissues. This view is based on SCN ablation studies showing that in the absence of the SCN all peripheral clocks become arrhythmic. An obvious flaw of SCN ablations is the concomitant scission of SCN afferents and efferents. Here we use a genetic model of SCN clock disruption. We generated a SCN Cre driver mouse line (Syt10Cre) and demonstrated strong Cre activity in the majority of SCN cells, but none in peripheral tissues with the exception of the testis. The Syt10Cre driver line was functionally validated by deleting a conditional allele of the essential clock gene Bmal1 (Bmal1fl/fl). Syt10Cre Bmal1fl mice were analyzed for their wheel running behavior in light dark (LD) and constant darkness (DD) conditions. We found a dose-dependent phenotype ranging from minor changes in period and amplitude in Syt10Cre/+ Bmal1fl/fl to markedly reduced rhythmicity in Syt10Cre/+ Bmal1fl/- mice to a complete loss of circadian rhythmicity in Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice. The behavioral phenotype of Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice was indistinguishable from the phenotype of Bmal1-/- mice, confirming the efficiency of SCN disruption. Furthermore the behavioral phenotype of Syt10Cre Bmal1fl mice was inversely correlated with the number of BMAL1 positive cells in the SCN. The Syt10Cre line will be a helpful tool to investigate the complexity of the mammalian circadian network. In the second part of this thesis Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice are used to investigate the hierarchical structure of the mammalian circadian timing system. A major difference to the above-mentioned SCN ablation studies is that Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice still show rhythmic wheel running behavior in LD conditions. We showed that this behavioral synchronization to the LD cycle is directly light- and not clock-driven. The disruption of the SCN clock on the molecular level was confirmed by in situ hybridization. Despite the absence of a functional SCN clock, corticosterone is rhythmic in Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice in LD. However the amplitude of this rhythm is markedly reduced, indicating that although the SCN clock is dispensable for rhythmic release of corticosterone in LD, the amplitude of this rhythm is regulated by the SCN clock. Upon placing the mutant animals into DD, corticosterone rhythms dampen, indicating that in DD the SCN clock is essential for maintenance of corticosterone rhythmicity. Furthermore we analyze clock gene expression rhythms in peripheral tissues of Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice in LD and DD. To our surprise, peripheral clocks continue to oscillate in Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- mice in LD. This indicates that a functional clock in the SCN is not necessary for synchronized rhythmicity of peripheral clocks, but that light can directly synchronize peripheral clocks. Upon release into DD, however, clock gene rhythms in peripheral organs dampen. Thus in constant conditions the SCN clock is necessary to synchronize peripheral clocks. The third part of this thesis describes the first attempts towards the development of a combinatorial Cre system, which will allow very specific targeting of brain nuclei. The idea is based on complementation of two parts of the Cre enzyme, which individually are not active. If co-expressed in one cell, however, functional Cre is reconstituted. Expression of the two Cre parts under the control of different but overlapping promoters will markedly improve the specificity of the conventional Cre/loxP system. We aimed at investigating the functional anatomy of the SCN by targeting the SCN-core region which is believed to be the input region of the SCN. This SCN-core Cre line will then be used to set very specific genetic lesions to this SCN sub-region. It will be very interesting to analyze the effects of this SCN-core ablation on circadian output, which will help to elucidate the functional anatomy of this complex brain nucleus. The fourth part of this thesis addresses the role of the circadian clock in integrating different physiological systems. It has been shown that the circadian clock and metabolic regulation are tightly linked. In addition, sleep curtailment (which is often experienced during shift work) is associated with negative effects on metabolic homeostasis. This prompted us to analyze whether the clock might mediate the negative effects of sleep disturbance on metabolic regulation. Our hypothesis was that in the absence of a functional clock metabolic effects of sleep disruption should be less pronounced. We were able to show that arrhythmic Per1/2 mutants which lack a functional circadian clock indeed show less metabolic alterations after sleep disturbance, indicating that the circadian clock is involved in regulating this response. This study suggests that the circadian clock integrates sleep and metabolic regulation. Thus our work may help to understand the effects of sleep curtailment on obesity, which are major problems of industrialized societies. Deepening the understanding of the underlying mechanisms could contribute to the development of new pharmaceutical approaches for these disorders.
Keywords: circadian; clock; cre/loxp; transgenic mice; suprachiasmatic nucleus
Other Languages
Alles Leben dieser Erde ist dem täglich
wiederkehrenden Wechsel von Tag und Nacht ausgesetzt. Um sich
diesen Ryhtmen anzupassen, haben fast alle Lebewesen, vom Bakterium
bis zum Menschen, zirkadiane Uhren entwickelt. Mittels solcher
interner Zeitmesser können Lebewesen diese Rhythmen antizipieren
und ihre Physiologie optimal anpassen. Der erste Teil dieser Arbeit
beschreibt die Herstellung und Validierung eines neuen transgenen
Mausmodels, in dem die zentrale zirkadiane Uhr ausgeschaltet wurde.
Es ist allgemein anerkannt, dass das zirkadiane System von Säugern
hierarchisch organisiert ist, mit einem zentralen Schrittmacher im
Nucleus Suprachiasmaticus (SCN) des Hypothalamus und
untergeordneten peripheren Uhren. Dieses Modell beruht auf
SCN-Läsionsstudien, die zeigen, dass in Abwesenheit des SCN alle
peripheren Uhren arrhythmisch werden. Der Nachteil von Läsionen
ist, dass gleichermaßen afferente und efferente Verbindungen
durchtrennt werden. In dieser Arbeit wurde daher ein genetisches
Modell genutzt. Eine SCN-Cre-Treiberlinie (Syt10Cre) wurde
hergestellt, in der gezeigt werden konnte, dass Cre im Großteil der
SCN-Zellen aktiv ist, nicht aber in peripheren Geweben mit Ausnahme
des Testis. Zur funktionellen Charakterisierung wurde mittels der
Syt10Cre-Linie das essentielle Uhrengen Bmal1 deletiert
(Bmal1fl/fl). Die Laufradaktivität von Syt10Cre Bmal1fl-Mäusen
wurde unter Licht-Dunkel (LD) Bedingungen und in konstanter
Dunkelheit (DD) untersucht. Es konnte ein Dosis-abhängiger Phänotyp
gefunden werden: je weniger Zellen im SCN noch BMAL1-Protein
exprimierten, desto weniger rhythmisch war die Laufradaktivität.
Syt10Cre/Cre Bmal1fl/--Tiere wurden in konstanter Dunkelheit
komplett arrhythmisch, und zeigten denselben Phänotyp wie Mäuse, in
denen das Bmal1 Gen in allen Zellen deletiert ist (Bmal1-/-), was
die Effizienz der genetischen Manipulation bestätigt. Die
Syt10Cre-Treiberlinie wird hilfreich sein, um die Komplexität des
zirkadianen Systems von Säugern zu untersuchen. Im zweiten Teil der
Arbeit wurde die hierarchische Organisation des zirkadianen Systems
an Hand des beschriebenen Syt10Cre/Cre Bmal1fl/--Mausmodels
untersucht. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der oben beschriebenen
SCN-Läsionsstudien wurde gefunden, dass Syt10Cre/Cre
Bmal1fl/--Mäuse unter LD-Bedingungen rhythmische Aktivität zeigen.
Es konnte nachgewiesen werden, dass diese rhythmische Aktivität
direkt Licht- und nicht Uhren-gesteuert ist. Außerdem wurde auch
auf molekularer Ebene gezeigt, dass die Uhr im SCN komplett defekt
ist. Trotz nicht funktioneller SCN-Uhr wurden unter LD-Bedingungen
Glukokortikoide rhythmisch von der Nebenniere sezerniert. Dieser
Glukokortikoidrhythmus war im Vergleich zu dem von Wildtyp-Tieren
allerdings deutlich gedämpft. Daraus lässt sich ableiten, dass die
Uhr im SCN für die rhythmische Glukokortikoidsekretion zwar nicht
notwendig ist, aber an der Regulierung der Amplitude des Rhythmus
beteiligt ist. Entlässt man diese Tiere in konstante Dunkelheit
schwächt sich der Glukokortikoidrhythmus immer weiter ab, was
darauf hinweist, dass in konstanter Dunkelheit die Uhr im SCN
notwendig ist, um einen Glukokortikoidrhythmus aufrechtzuerhalten.
Des Weiteren wurden unter LD-Bedingungen Uhrengene in peripheren
Organen von Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- Mäusen gemessen. Überraschend
war, dass periphere Uhren in Syt10Cre/Cre Bmal1fl/- Mäusen in LD
rhythmisch waren, was darauf hindeutet, dass der SCN als Gewebe
zwar notwendig ist um periphere Uhren zu synchronisieren, die
SCN-Uhr per se aber nicht. Sobald die Tiere in konstante Dunkelheit
entlassen wurden, konnte eine deutliche Dämpfung der Rhythmen in
peripheren Uhren gemessen werden. Einige Uhrengene waren sogar
komplett arrhythmisch exprimiert, was die hierarchische Struktur
des zirkadianen Systems unter konstanten Bedingungen bestätigt. Im
dritten Teil dieser Arbeit werden die ersten Schritte zur
Entwicklung eines kombinatorischen Cre-Systems beschrieben. Dieses
kombinatorische Cre-System soll sehr spezifische genetische
Manipulationen im Mausmodell ermöglichen. Die Idee basiert auf der
Komplementierung zweier Cre-Teilproteine, die einzeln nicht aktiv
sind. Sind sie aber in einer Zelle co-exprimiert, wird
funktionelles Cre-Protein wiederhergestellt. Indem man beide Teile
unter der Kontrolle verschiedener, aber überlappender Promotoren
exprimiert, kann man ein deutlich spezifischeres
Cre-Expressionsmuster erreichen, als es bisher möglich war. Ziel
ist es, die funktionelle Anatomie des SCNs zu untersuchen, indem
man die sogenannte „Core“-Region des SCN genetisch läsioniert. Es
wird sehr interessant sein, die Effekte einer solchen genetischen
SCN-Core Läsion auf das zirkadiane System zu untersuchen. Dieses
Projekt wird dazu beitragen, die funktionelle Anatomie dieses
komplexen Nukleus besser zu verstehen. Der vierte Teil dieser
Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle der zirkadianen Uhr als
Vermittler zwischen verschiedenen physiologischen Systemen. Es ist
bekannt, dass die zirkadiane Uhr und die metabolische Regulation
eng miteinander verknüpft sind. Außerdem ist eine kürzere
Schlafdauer mit metabolischen Dysfunktionen assoziiert, wie zum
Beispiel einer erhöhten Wahrscheinlichkeit von Fettleibigkeit. Eine
Möglichkeit ist, dass die metabolischen Effekte von Schlafentzug
durch die zirkadiane Uhr vermittelt werden. Daher war die Hypothese
dieser Studie, dass in Abwesenheit einer funktionellen zirkadianen
Uhr die metabolischen Auswirkungen von Schlafentzug reduziert sind.
Um dies zu testen, wurden transgene Mäuse untersucht, die keine
funktionelle Uhr besitzen (Per1/2-Doppelmutanten). Es konnte
gezeigt werden, dass Schlafentzug in Per1/2-Doppelmutanten
tatsächlich weniger metabolische Auswirkungen hat, was nahelegt,
dass die zirkadiane Uhr an der Vermittlung dieser Effekte beteiligt
ist. Diese Studie gibt erste Hinweise, dass die zirkadiane Uhr
möglicherweise ein wichtiger Integrator für Schlaf und Metabolismus
ist. Außerdem ist sie klinisch relevant, da Schlafentzug und
Fettleibigkeit essentielle Probleme unserer industrialisierten
Gesellschaft sind. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden
Mechanismen kann zur Entwicklung neuer pharmakologischer Ansätze
beitragen.
Schlagwörter: circadiane uhr; cre/loxp; suprachiasmatic nucleus