New genetic mouse models for neurodegenerative diseases: Contribution of noradrenaline to Alzheimer’s disease pathogenesis and creation of a new genetic model for Parkinson’s disease.

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen gehören zu den Krankheiten mit den schwerwiegendsten Folgen, für die es bis heute keine Heilung gibt. Mit zunehmendem Alter steigt das Risiko für die Erkrankung. Ein Merkmal, das allen diesen Krankheiten gemeinsam ist, ist die Ablagerung toxischer Proteine. Alzheimer ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen von sogenannten Aß-Peptiden, während intraneuronale α-Synuclein Ablagerungen (Lewy-Körperchen) symptomatisch für Parkinson sind. Diese Arbeit nutzt genetische Methoden, um offene Fragen über diese Krankheiten zu beantworten, die durch bisherige genetische Modelle nicht geklärt werden konnten. Aß-Peptide zählen zu den wichtigsten Merkmalen der Alzheimer-Krankheit. Den kognitiven Beeinträchtigungen geht ein symptomfreies Stadium voraus. Die Degeneration des Locus coeruleus (LC) ist ein frühes Merkmal von Alzheimer. LC-Degeneration findet bevorzugt in rostralen Regionen dieses Nukleus statt, die zum Cortex und zum Hippocampus projizieren. Dieselben Regionen sind in Alzheimer-Patienten als erstes betroffen und spielen eine wichtige Rolle für Lernen und Gedächtnis. Der LC projiziert zu allen Regionen des Gehirns und stellt die einzige Noradrenalin-Quelle für den Cortex, das limbische System und das Cerebellum dar. Der LC hat umfassende Aufgaben: Er spielt zum Beispiel eine Rolle für die Aufmerksamkeit, die Alarmbereitschaft und die sensorische Verarbeitung. Außerdem wurde eine Funktion des LC für kognitive Funktionen wie synaptische Plastizität, Gedächtnis und Steuerung von Handlungen gezeigt. Obwohl es viele genetische Mausmodelle für Alzheimer gibt, wird der frühe Verlust von LC-Neuronen in diesen bisher nicht widergespiegelt. Wie der Abbau des LCs zu der Entstehung von Alzheimer beiträgt, bleibt somit unbekannt. Bisher wurde dieser Frage entweder durch chirurgische Entfernung der LC-Zellen oder mittels chemischer Entfernung durch das Neurotoxin N-(2-Chloroethyl)-N-ethyl-2-bromobenzylamine (DSP-4) nachgegangen. Diese Methoden sind sowohl invasiv als auch unspezifisch; zudem können sie kompensatorische Antworten auf den Eingriff hervorrufen. Daher haben wir einen genetischen Ansatz entwickelt, der besser für die Untersuchung der Folgen von LC-Verlust während der Alzheimer Entstehung geeignet ist. Dafür wurden Ear2-mutante Mäuse, die durch einen Verlust von LC-Neuronen gekennzeichnet sind, mit einem doppelt-transgenen Mausmodell für Alzheimer (APP/PS1) gekreuzt. In Ear2-Mäusen konnte eine 56%ige Reduktion der Zahl der LC-Zellen beobachtet werden, unabhängig von der Anwesenheit der Alzheimer-Transgene (APP/PS1). Im Alter von 6 Monaten hatte der Verlust von Noradrenalin noch keine Auswirkungen auf die Menge an Aß-Peptiden, aber der Noradrenalinspiegel korrelierte mit der Stärke der Innervation durch den LC. Die Transgene APP/PS1 hatten keinen Effekt auf den Noradrenalinspiegel. Die Reduktion des Noradrenalinspiegels in jungen Mäusen war am stärksten in den Arealen, die vom LC innerviert werden. Im olfaktorischen Bulbus, Frontalkortex und Hippocampus konnte eine 65%ige, 53%ige beziehungsweise 70%ige Reduktion von Noradrenalin beobachtet werden. Im Cerebellum, das weniger stark vom LC innerviert ist, konnte nur eine 32%ige Reduktion gemessen werden. Wie oben bereits erwähnt, sind die am stärksten betroffenen Regionen wichtig für Lernen und das Gedächtnis und in Alzheimer-Patienten stark beeinträchtigt. Sowohl Ear2- als auch APP/PS1-mutante Mäuse zeigten Defizite im räumlichem Lernen und der Langzeitpotenzierung (LTP). In Mäusen, in denen beide Mutationen kombiniert wurden, waren die Lern- und LTP-Defizite stärker als in den Einzelmutanten. Durch Paired-Pulse Facilitation (PPF) konnte gezeigt werden, dass die Kurzzeit-Plastizität nicht beeinträchtigt ist. Zudem war das Verhältnis der PPF vor und nach LTP Induktion unverändert, was darauf hindeutet, dass präsynaptische Terminals nicht beeinträchtigt waren. Es ist wichtig hervorzuheben, dass die kognitiven Defizite in Ear2-Mutanten tatsächlich durch den Verlust von Noradrenalin verursacht wurden, da die Behandlung mit dem Noradrenalin-Agonist L-Threo-DOPS die kognitiven Fähigkeiten der Mutanten wiederherstellen konnte. Zusammengenommen spricht sowohl die Potenzierung der kognitiven Defizite in Alzheimer-Mutanten durch zusätzliche Degeneration des LC als auch die Tatsache, dass die kognitiven Fähigkeiten zumindest teilweise durch die Gabe von Noradrenalin wiederhergestellt werden konnten, dafür, dass Noradrenalin eine wichtige Rolle in der Entstehung von Alzheimer spielt. Die Anzahl der LC-Neurone wurde weder durch Alter noch durch chronischen Noradrenalinmangel beeinflusst. In älteren Mäusen konnte im olfaktorischen Bulbus, Frontalkortex, Hippocampus und Cerebellum eine 76%ige, 60%ige, 75%ige beziehungsweise 51%ige Reduktion von Noradrenalin beobachtet werden. Die verstärkte Reduktion von Noradrenalin im Vergleich zu jüngeren, 3 Monate alten Mäusen, weist darauf hin, dass chronischer Noradrenalinmangel mit zunehmendem Alter verstärkt wird. Beim Vergleich des Noradrenalinspiegels von 1 Jahr und 3 Monate alten Mäusen konnte in Wildtyp-Mäusen keine Veränderung festgestellt werden, wohingegen Ear2-Mutanten und APP/PS1-Mäuse im Alter eine Noradrenalinreduktion von 25% zeigten. Mäuse, in denen beide Mutationen kombiniert wurden, verloren doppelt so viel Noradrenalin mit zunehmendem Alter als die Einzelmutanten. Daraus kann geschlossen werden, dass in Wildtyp-Mäusen das Alter den Noradrenalinspiegel nicht beeinflusst, während sowohl die chronische Überexpression von APP/PS1 als auch die chronische Reduktion des Noradrenalinspiegels das noradrenerge System dereguliert. Diese Deregulierung des noradrenergen Systems bei der Alzheimer-Erkrankung spiegelt die frühen Stadien dieser Krankheit im Menschen wider. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass dieses neue Mausmodell die folgenden Merkmale vereint: Verlust von LC-Neuronen, verminderter Noradrenalinspiegel, stärkere kognitive Defizite als in bisherigen Alzheimer-Modellen und einen Alzheimer-Phänotyp, der sich mit zunehmendem Alter verstärkt. Diese Merkmale machen dieses neue Mausmodell zu einem idealen Modell, um die frühen Stadien der Alzheimer-Entstehung und den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass Noradrenalin eine wichtige Rolle in der Entstehung von Alzheimer spielt. Noradrenalin stellt daher einen vielversprechenden therapeutischen Angriffspunkt dar, um die frühen kognitiven Defizite im Verlauf der Alzheimer-Erkrankung zu vermindern. Morbus Parkinson ist charakterisiert durch die Anhäufung von Lewy-Körperchen in Neuronen des dopaminergen Systems im Gehirn. Der Hauptbestandteil dieser Lewy-Körperchen ist α-Synuclein (SNCA). Sowohl in genetischen Parkinson-Modellen als auch in Patienten mit Duplikationen und Triplikationen des SNCA-Gens konnte gezeigt werden, dass Parkinson von der SNCA-Gen-Dosis abhängig ist. Bisherige genetische Parkinson-Modelle basieren vor allem auf SNCA-Überexpressionsstudien. Diese Modelle spiegeln aber nicht alle Parkinson-Merkmale wider, zum Beispiel wird der Verlust von Neuronen nicht in allen Modellen beobachtet. Strukturbiologische und in vivo Studien konnten zeigen, dass eine bestimmte Mutation im SNCA-Gen, die durch drei Substitutionen zu Prolinen (TP-SNCA) charakterisiert ist, zu reduzierter Bildung von Fibrillen und gleichzeitig zu mehr löslichen Oligomeren führt, was höhere Toxizität hervorruft. Dieser Teil der Arbeit hatte zum Ziel ein neues genetisches Mausmodell für Parkinson zu etablieren, mit dem die Toxizität der TP-SNCA Mutation in der Maus getestet werden kann. Diese Arbeit beschreibt die Klonierungsstrategie, die genutzt wurde, um den Targetingvektor für ein neues konditionelles Knock-in/Knock-out Mausmodell herzustellen. Die Idee ist, das humane Wildtyp-SNCA-Gen konditionell unter der Kontrolle des endogenen murinen SNCA-Lokus zu exprimieren. Nach Verpaarung mit der DAT-Cre-Linie werden die Nachkommen die TP-SNCA-Mutation nur in dopaminergen Neuronen exprimieren. Es ist wichtig hervorzuheben, dass dieses Modell nicht auf Überexpression des SNCA-Gens basiert. Endogene Expressionslevel des humanen Wildtyp-SNCA-Gens werden sichergestellt, indem das Start-Codon des murinen SNCA-Gens durch das Transgen ersetzt wird. Zusätzlich ist die Expression des mutanten SNCA-Gens räumlich und zeitlich regulierbar. Indem die Expression des mutanten SNCA-Gens auf dopaminerge Neuronen beschränkt wird, wird die Spezifität des Systems enorm erhöht. Bisher konnten zwei positive ES-Zell-Klone identifiziert werden; diese werden jetzt in Blastozysten injiziert. Durch die sowohl räumlich und zeitlich als auch über die Dosis regulierbare Expression der SNCA-Mutation ist dieses neue Mausmodell sehr gut geeignet um die Toxizität der TP-SNCA Mutation zu untersuchen. Außerdem kann dieses Modell genutzt werden, um das mutante SNCA-Gen auch in anderen Zellpopulationen zu exprimieren, was weiteren Aufschluss über Toxizität dieser Mutation und deren Rolle in der Entstehung von Parkinson geben wird.