Astroglial glutamate transporters are essential for maintenance of respiratory activity in the rhythmic slice preparation
Astrogliale Glutamat-Transporter sind für die Erhaltung der respiratorischen Aktivität im rhythmischen Schnittpräprat notwendig
von Christian Schnell
Datum der mündl. Prüfung:2011-08-26
Erschienen:2012-01-25
Betreuer:Prof. Dr. Swen Hülsmann
Gutachter:Prof. Dr. Swen Hülsmann
Gutachter:Prof. Dr. Gabriele Flügge
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Zusammenfassung
Englisch
Astrocytes are the major type of glial cells in the brain and were already described in the 19th century by Rudolf Virchow. The physiological investigation of astrocytes has long been hampered by difficulties to identify astrocytes during physiological experiments. Apart from using transgenic mice with astrocytes expressing fluorescent proteins, the method of selectively labeling astrocytes with the fluorescent dye Sulforhodamine 101 (SR101) emerged in recent years. SR101 was reported to label astrocytes in the hippocampus and the neocortex of rodents. However, here it was shown that SR101 labeling was not sufficient to reliably identify astrocytes in the brainstem. Investigations of the cause of this discrepancy revealed that passive diffusion of SR101 via gap junction or pannexin hemichannels does not account for the labeling differences. Since the inhibitor of ATP-binding cassette transporters, MK-571 blocked astroglial SR101 labeling in the hippocampus but did not improve SR101 labeling of brainstem astrocytes, active transport of SR101 into hippocampal astrocytes via a not yet identified, MK-571 sensitive transporter is more probable. During rhythmic bursting activity of respiratory neurons in the pre-Bötzinger Complex (preBötC), extracellular concentrations of K+ and neurotransmitters increase rhythmically. It was found in this study, that around 10 % of the patched astrocytes detected these rhythmic changes of the extracellular milieu and showed respiratory-related current fluctuations that based on Kir4.1 channels and glutamate transporters. It was further tested under different conditions for Ca2+-dependent coupling of astrocytes to neurons in the preBötC. Astrocyte-to-neuron communication is mostly dependent on intracellular Ca2+ signals in astrocytes. Though, during normal respiratory activity and in conditions of increased activity after blockade of inhibitory transmission, we found no correlation between respiratory bursts and [Ca2+]in in preBötC astrocytes. Only after blocking the glial glutamate uptake and subsequent increase of extracellular glutamate levels, astroglial Ca2+ oscillations were induced. Furthermore, depolarization of single astrocytes during normal respiratory activity did not affect respiratory bursts. Thus, we conclude that during normal respiratory activity, coupling between astrocytes and neurons in the preBötC is low. However, the astroglial glutamate uptake is essential for maintenance of respiratory network activity and adds further data for the importance of astrocytes in the preBötC.
Keywords: Glia; astrocyte; respiratory network; calcium imaging; 2-photon microscopy; elektrophysiology; immunohistochemistry; sulforhodamine 101; glutamate transporter; Kir4.1; potassium channel
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Astrozyten sind die häufigste Gliazellart
im Gehirn und wurden bereits im 19. Jahrhundert von Rudolf Virchow
beschrieben. Physiologische Untersuchungen an Astrozyten wurde
lange Zeit durch nicht vorhandene Möglichkeiten der Identifikation
von Astrozyten während eines physiologischen Experiments erschwert.
Neben der Nutzung von transgenen Mäusen, die in ihren Astrozyten
ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wurde in den letzten
Jahren immer häufiger ein fluoreszierender Farbstoff, Sulforhodamin
101 (SR101) genutzt, der selektiv Astrozyten anfärbt. Es wurde
berichtet, dass SR101 Astrozyten im Neocortex und Hippocampus von
Nagern selektiv anfärbt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt,
dass die SR101-Färbung im Hirnstamm nicht ausreicht, um Astrozyten
im Hirnstamm zuverlässig zu identifizieren. Die Experimente haben
gezeigt, dass passive Diffusion von SR101 durch Gap Junction- oder
Pannexin-Hemichannel nicht für die SR101-Aufnahme verantwortlich
sein kann. Da MK-571 als Inhibitor von ABC-Transporter die
astrogliale SR101-Färbung im Hippocampus blockiert, die
SR101-Färbung in den Hirnstamm-Astrozyten aber nicht verbessert,
ist wahrscheinlich ein aktiver Transport von SR101 in Astrozyten
des Hippocampus mittels eines noch nicht identifizierten,
MK-571-sensitiven Transporters für die selektive SR101-Aufnahme
verantwortlich. Durch rhythmische Bursting-Aktivität von
respiratorischen Neuronen im pre-Bötzinger Komplex (preBötC)
ergeben sich rhythmische Erhöhungen der extrazellulären
Konzentrationen von K+ und Neurotransmittern. In der
vorliegenden Arbeit wurde herausgefunden, dass 10 % der gepatchten
Astrozyten diese rhythmischen Veränderungen des Extrazellulärraums
detektieren und Strom-Fluktuationen zeigen, die parallel zu den
respiratorischen Bursts auftreten und auf Kir4.1-Kanälen und
Glutamat-Transportern basieren. Weiterhin wurde unter verschiedenen
Bedingungen getestet, ob im preBötC eine Ca2+-abhängige
Kopplung zwischen den Astrozyten und den Neuronen existiert, da die
Kommunikation zwischen Astrozyten und Neuronen meistens auf
intrazellulären Ca2+-Signalen in Astrozyten beruht.
Während der regulären respiratorischen Aktivität oder nach Blockade
der inhibitorischen Transmission wurde allerdings keine Korrelation
zwischen den respiratorischen Bursts und der intrazellulären
Ca2+-Konzentration in Astrozyten gefunden. Erst nach
Blockade der glialen Glutamat-Aufnahme und der dadurch verursachten
Erhöhung der extrazellulären Glutamat-Konzentration wurden
Ca2+-Oszillationen in Astrozyten induziert. Weiterhin
veränderte die Depolarisation eines einzelnen rhythmischen
Astrozyten während der regulären respiratorischen Aktivität den
respiratorischen Rhythmus nicht. Aus den Experimenten schließen
wir, dass während der regulären respiratorischen Aktivität, die
Kopplung zwischen Astrozyten und Neuronen im preBötC sehr gering
ist. Allerdings ist die astrogliale Glutamataufnahme essentiell für
die Aufrechterhaltung der Aktivität des respiratorischen Netzwerks.
Somit unterstreicht die vorliegende Arbeit die Bedeutung von
Astrozyten im preBötC.
Schlagwörter: Glia; Astrozyt; respiratorisches Netzwerk; Calcium Imaging; 2-Photonen-Mikroskopie; Elektrophysiologie; Immunohistochemie; Sulforhodamin 101; Glutamat-Transporter; Kir4.1; Kalium-Kanal