Characterization of synaptic protein complexes in Drosophila melanogaster
Charakterisierung von synaptischen Proteinkomplexen in Drosophila melanogaster
von Manuela Schmidt
Datum der mündl. Prüfung:2006-04-26
Erschienen:2006-08-25
Betreuer:Prof. Dr. Stephan Sigrist
Gutachter:Prof. Dr. Stephan Sigrist
Gutachter:Prof. Dr. Fred Wouters
Gutachter:Prof. Dr. Herbert Jäckle
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Size:3.89Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Synaptic transmission at chemical synapses is directional: the presynapse is defined as the compartment from which neurotransmitter is released. The postsynaptic site harbors the machinery for neurotransmitter reception and integration, which is located precisely opposite to presynaptic release sites. The notion is evolving that synapse assembly, maturation, maintenance and plasticity depend on multifaceted protein-protein and protein-lipid interactions within dynamic macromolecular complexes. The determination of the composition of synaptic multiprotein complexes is critical to understand synaptic physiology. But so far studies on those protein networks are predominantly performed in vitro. Only recently, advancements in mass spectrometry (MS) provided the basis for studies on in vivo-derived protein complexes enabling the determination of their contents from native tissues. The objective of this work was to identify and functionally characterize synapse-related protein complexes in Drosophila melanogaster. The physiological relevance of the obtained data should be further tested by a comprehensive genetic analysis at the larval NMJ, a well established synaptic model system. To this end, the thesis focused on two proteins our lab has been working on: 1. The Glutamate-receptor-interacting protein (DGrip), a seven PDZ-domain containing protein. Previous studies in our lab revealed that DGrip coordinates the complex process of muscle guidance during early embryogenesis. A yeast two hybrid screen identified the cell adhesion molecule Echinoid (Ed) as a binding partner of DGrip. Further analysis suggested that Ed and DGrip might act in concert to regulate embryonic muscle guidance possibly by regulating adhesion between muscle and epidermal cells. In addition, a combination of Y2H and RNAi approaches provided hints towards a role of DGrip in regulating presynaptic neurotransmitter release at the larval NMJ. The data support the notion that DGrip functions as a dynamic scaffolding molecule to mediate many transport-dependent processes. 2. Drosophila Bruchpilot (BRP), a novel coiled-coil protein with homologies to the CAST/ERC/ELKS family. BRP is a component of transmitter release sites (active zones) in presynaptic terminals. The analysis of brp mutants pointed towards a role of BRP in organizing active zones and synaptic vesicle release. A MS-based functional proteomics approach identified proteins, which co-immunoprecipitated with BRP from adult fly head extracts. Among them were Still life (SIF) and SYD-1, both regulators of the Rho family of small GTPases. A combination of biochemical and genetic approaches suggested that SIF might influence the presentation of BRP at synapses. In addition, the identification of Neurexin and Slowpoke as putative components of BRP protein complexes strengthened the role of BRP as an organizer of active zones. This work dissected in-vivo-derived BRP complexes on the molecular level. These data could provide considerable insight into transport of active zone components and the assembly of the presynapse. As basic principles of synapse formation are often evolutionary conserved, the obtained data should be translatable into vertebrates.
Keywords: Synapse; NMJ; Proteomics; active zone
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An chemischen Synapsen erfolgt die
Signalübermittlung gerichtet: The Präsynapse ist das Kompartment,
das Neurotransmitter ausschüttet, wohingegen die Postsynapse genau
gegenüber der Präsynapse liegt und für die Rezeption des
Neurotransmitters und die Integration des Signals verantwortlich
ist. In den letzten Jahren kristallisierte sich heraus, dass
Etablierung, Wachstum, Erhaltung und Plastizität von Synapsen von
verschiedenartigsten Protein-Protein Wechselwirkungen und
Protein-Lipid Wechselwirkungen innerhalb dynamischer
makromolekularer Komplexe abhängen. Die Erforschung einzelner
Komponenten dieser Proteinkomplexe ist unabdinglich für unser
Verständnis zur Physiologie von Synapsen. Aber bisher wurden
vorwiegend in vitro Studien an diesen
Protein-Netzwerken durchgeführt. Neueste Entwicklungen auf dem
Gebiet der Massenspektrometrie (MS) ermöglichen heutzutage auch die
Erforschung endogener Proteinkomplexe, die direkt aus dem
jeweiligen Gewebe extrahiert wurden. Das Ziel dieser Arbeit war es,
solche endogenen Proteinkomplexe an Synapsen in Drosophila melanogaster zu identifizieren und zu
charakterisieren. Dabei sollte deren physiologische Bedeutung durch
genetische Analyse an der larvalen neuromuskulären Endplatte – ein
Modellsystem für Synapsen – evaluiert werden. Zu diesem Zweck
beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit zwei Proteinen, die in
unserem Labor untersucht werden. 1. Das
Glutamate-receptor-interacting Protein (DGrip), welches sieben
PDZ-Domänen hat. Frühere Studien in unserem Labor zeigten, dass
DGrip den komplexen Vorgang der Etablierung der Muskeln während der
Embryogenese steuert. Mittels eines Hefenscreens wurde das
Zelladhesionsmolekül Echinoid (Ed) als Bindepartner von Dgrip
identifiziert. Weitere Studien deuteten darauf hin, dass Ed und
DGrip zusammen die Etablierung der Muskeln während der Embryogenese
dadurch steuern, indem sie die Adhesion zwischen Muskel und
Epidermis regulieren. 2. Drosophila Bruchpilot (BRP), ein neues
coiled-coil Protein, das der CAST/ERC/ELKS Familie homolog ist. BRP
ist ein Bestandteil der Aktiven Zone in der Präsynapse und brp
Mutanten lassen vermuten, dass BRP möglicherweise diese Aktiven
Zonen und dadurch die Vesikelausschüttung reguliert. Basierend auf
Massenspektrometrie wurde ein Proteomics Experiment etabliert und
durchgeführt um Proteine, die mit BRP koimmunipräzipitieren aus
Extrakten von Fliegenköpfen zu identifizieren. Auf diese Weise
wurden Still life (SIF) und SYD-1 – beide Proteine, die die kleinen
GTPasen der Rho-Familie regulieren - identifiziert und deren
Einfluss auf die Präsentation von BRP an den Synapsen durch
biochemische und genetische Methoden untersucht. Außerdem, weist
auch der Fund von Neurexin und Slowpoke als Bindungspartner von BRP
darauf hin, dass BRP als eine Art „Organisator“ der Aktiven Zonen
fungieren könnte. Diese Arbei hat endogene Proteinkomplexe von BRP
auf molekularer Ebene untersucht. Die gewonnen Daten können
Einblicke in den Transport und die Zusammensetzung der Komponenten
der Aktiven Zonen geben und sollten aufgrund der evolutiven
Konservierung auch auf Vertebraten-Modelle übertragen werden
können.
Schlagwörter: Synapse; neuromuskuläre Endplatte; Proteomics; Aktive Zone