Characterization of synaptic protein complexes in Drosophila melanogaster

Abstract

An chemischen Synapsen erfolgt die Signalübermittlung gerichtet: The Präsynapse ist das Kompartment, das Neurotransmitter ausschüttet, wohingegen die Postsynapse genau gegenüber der Präsynapse liegt und für die Rezeption des Neurotransmitters und die Integration des Signals verantwortlich ist. In den letzten Jahren kristallisierte sich heraus, dass Etablierung, Wachstum, Erhaltung und Plastizität von Synapsen von verschiedenartigsten Protein-Protein Wechselwirkungen und Protein-Lipid Wechselwirkungen innerhalb dynamischer makromolekularer Komplexe abhängen. Die Erforschung einzelner Komponenten dieser Proteinkomplexe ist unabdinglich für unser Verständnis zur Physiologie von Synapsen. Aber bisher wurden vorwiegend in vitro Studien an diesen Protein-Netzwerken durchgeführt. Neueste Entwicklungen auf dem Gebiet der Massenspektrometrie (MS) ermöglichen heutzutage auch die Erforschung endogener Proteinkomplexe, die direkt aus dem jeweiligen Gewebe extrahiert wurden. Das Ziel dieser Arbeit war es, solche endogenen Proteinkomplexe an Synapsen in Drosophila melanogaster zu identifizieren und zu charakterisieren. Dabei sollte deren physiologische Bedeutung durch genetische Analyse an der larvalen neuromuskulären Endplatte – ein Modellsystem für Synapsen – evaluiert werden. Zu diesem Zweck beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit zwei Proteinen, die in unserem Labor untersucht werden. 1. Das Glutamate-receptor-interacting Protein (DGrip), welches sieben PDZ-Domänen hat. Frühere Studien in unserem Labor zeigten, dass DGrip den komplexen Vorgang der Etablierung der Muskeln während der Embryogenese steuert. Mittels eines Hefenscreens wurde das Zelladhesionsmolekül Echinoid (Ed) als Bindepartner von Dgrip identifiziert. Weitere Studien deuteten darauf hin, dass Ed und DGrip zusammen die Etablierung der Muskeln während der Embryogenese dadurch steuern, indem sie die Adhesion zwischen Muskel und Epidermis regulieren. 2. Drosophila Bruchpilot (BRP), ein neues coiled-coil Protein, das der CAST/ERC/ELKS Familie homolog ist. BRP ist ein Bestandteil der Aktiven Zone in der Präsynapse und brp Mutanten lassen vermuten, dass BRP möglicherweise diese Aktiven Zonen und dadurch die Vesikelausschüttung reguliert. Basierend auf Massenspektrometrie wurde ein Proteomics Experiment etabliert und durchgeführt um Proteine, die mit BRP koimmunipräzipitieren aus Extrakten von Fliegenköpfen zu identifizieren. Auf diese Weise wurden Still life (SIF) und SYD-1 – beide Proteine, die die kleinen GTPasen der Rho-Familie regulieren - identifiziert und deren Einfluss auf die Präsentation von BRP an den Synapsen durch biochemische und genetische Methoden untersucht. Außerdem, weist auch der Fund von Neurexin und Slowpoke als Bindungspartner von BRP darauf hin, dass BRP als eine Art „Organisator“ der Aktiven Zonen fungieren könnte. Diese Arbei hat endogene Proteinkomplexe von BRP auf molekularer Ebene untersucht. Die gewonnen Daten können Einblicke in den Transport und die Zusammensetzung der Komponenten der Aktiven Zonen geben und sollten aufgrund der evolutiven Konservierung auch auf Vertebraten-Modelle übertragen werden können.