Ein neu entdeckter Weg der Reparatur hydrolytisch geschädigter DNA-Cytosinreste, etabliert im thermophilen Archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH
A new discovered repair mechanism for hydrolytically damaged DNA cytosine residues, established in the thermophilic archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH
by Lars Schomacher
Date of Examination:2007-11-01
Date of issue:2007-11-21
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Referee:PD Dr. Wilfried Kramer
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The DNA bases cytosine, adenine and guanine can be deaminated at the exocyclic aminogroups by spontaneous hydrolysis. Cytosine deamination leads to the RNA base uracil and is of particular mutagenic relevance, because it (i) occurs often compared with the deamination of the other bases and (ii) leads if unrepaired to a C/G to T/A transition mutation in half of the progeny of a cell. The initiation of a sequence context independent (general) repair of uracil residues in DNA was so far attributed to uracil DNA glycosylases solely. These enzymes initiate a common mechanism of DNA repair, base excision repair. However, a general uracil DNA glycosylase was not discovered in some organisms so far. DNA of thermophilic organisms is exposed to a higher risk of mutations due to fundamental reasons. From that point of view it’s astonishing that no general acting uracil DNA glycosylase was detected in the thermophilic archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH until now. In the present work a uracil processing activity could be demonstrated after fractionating a cell mass fromM. thermautotrophicus ΔH. This activity was not due to a glycosylase but an endonuclease activity at uridine residues in DNA. Via mass spectrometry analysis, selection and inspection of adequate candidates it was possible to associate the activity with the gene product of the open reading frame mth212. The protein was so far characterized as a homologous enzyme of the ExoIII family of AP endonucleases. In addition to the known activities of ExoIII enzymes it has the ability to set strand breaks at the 5’-site of uridine residues in double stranded DNA independent of the opposing nucleotide and independent of the sequence context. By this strand break the enzyme creates 3’-OH and 5’-phosphate termini. An efficient repair of a U/G mismatch (the product of cytosine deamination in double stranded DNA) was detected with a protein extract from M. thermautotrophicus ΔH. Initiation of this repair was almost completely inhibited via specific adsorption of Mth212 to an anti-Mth212 antibody matrix. According to this the repair of the mismatch was initiated by the newly discovered DNA uridine endonuclease. The enzymes DNA uridine endonuclease (Mth212), DNA polymerase B, 5’-flap endonuclease and DNA ligase from M. thermautotrophicus ΔH were produced heterologous in E. coli, purified to near homogeneity and tested for their enzymatic activities in individual confirmations. It was possible to arrange a reconstitution of DNA uridine repair with this set of enzymes. However, the fraction of ligated repair intermediates (complete repair) was detected in a considerable less proportion as with the protein extract. This could be due to the choice of enzymes, especially the DNA polymerase, or the absence of repair factors.
Keywords: cytosine deamination; thermophilic archaeon; uridin endonuclease; uridine repair
Other Languages
Die DNA-Basen Cytosin, Adenin und Guanin
können an den exozyklischen Aminogrupen durch Hydrolyse spontan
desaminiert werden. Die Cytosin-Desaminierung führt zur RNA-Base
Uracil und ist von besonderer mutagener Bedeutung, da sie (i),
relativ zur Desaminierung anderer Basen, häufig stattfindet und
(ii) unrepariert zu C/G- nach T/A-Transitionsmutationen in der
Hälfte der Nachkommenschaft einer Zelle führt. Die Initiation einer
vom Sequenzkontext unabhängigen (generellen) Reparatur von
Uracilresten in DNA war bislang allein auf Uracil-DNA-Glykosylasen
zurückzuführen. Diese Enzyme leiten einen weit verbreiteten
Mechanismus der DNA-Reparatur, die Basen-Exzisions-Reparatur, ein.
Bei einigen Organismen ist jedoch bislang keine generelle
Uracil-DNA-Glykosylase entdeckt worden. DNA thermophiler Organismen
ist aus fundamentalen Gründen einem erhöhten Risiko an Mutationen
ausgesetzt. Aus diesem Grund ist es erstaunlich, dass beim
thermophilen Archaeon Methanothermobacter
thermautotrophicus ΔH bislang keine generell agierende
Uracil-DNA-Glykosylase entdeckt worden ist. In vorliegender Arbeit
konnte nach Fraktionierung einer Zellmasse vonM. thermautotrophicus ΔH eine Uracil
prozessierende Aktivität nachgewiesen werden. Bei dieser Aktivität
handelte es sich nicht um eine Glykosylase-, sondern eine
Endonuklease-Aktivität an Uridinresten in DNA. Über
massenspektrometrische Analyse, Selektion und Überprüfung
geeigneter Kandidaten, konnte dem Genprodukt des Leserahmens
mth212 diese Aktivität zugeordnet
werden. Das Enzym, das bisher nur als Homolog der ExoIII-Familie
von AP-Endonukleasen beschrieben worden war, ist zusätzlich zu den
bekannten Aktivitäten von ExoIII-Enzymen in der Lage, Strangbrüche
auf der 5‘ Seite eines Uridinrestes in doppelsträngiger DNA
unabhängig vom gegenüberliegenden Nukleotid und unabhängig vom
Sequenzkontext zu setzen. Durch diesen Strangbruch werden 3‘-OH und
5‘-Phosphat-Termini von dem Enzym erzeugt. Mit einem Proteinextrakt
von M. thermautotrophicus ΔH wurde eine
effiziente Reparatur einer U/G-Fehlpaarung (dem Produkt der
Cytosin-Desaminierung in doppelsträngiger DNA) beobachtet. Die
Initiation dieser Reparatur konnte über gezielte Adsorbtion von
Mth212 an eine anti-Mth212-Antikörpermatrix fast vollständig
verhindert werden. Die Reparatur der Fehlpaarung wurde demnach
durch die neu entdeckte DNA-Uridin-Endonuklease eingeleitet. Die
Enzyme DNA-Uridin-Endonuklease (Mth212), DNA-Polymerase B, 5‘
Flap-Endonuklease und DNA-Ligase aus M.
thermautotrophicus ΔH wurden heterolog in E. coli produziert, bis nahe an die Homogenität
gereinigt und die enzymatischen Aktivitäten in Einzelnachweisen
bestätigt. Eine Rekonstitution der DNA-Uridin-Reparatur konnte mit
diesem Satz an Enzymen durchgeführt werden. Dabei war jedoch der
Anteil an ligierten Reparaturintermediaten (vollständige Reparatur)
nur zu einem deutlich geringeren Anteil als mit dem Proteinextrakt
detektierbar. Das könnte an der Auswahl bestimmter Enzyme, vor
allem der DNA Polymerase, oder an einem Fehlen von
Reparaturfaktoren gelegen haben.
Schlagwörter: Cytosin-Desaminerung; thermophiles Archaeon; Uridin-Endonuklease; Uridin-Reparatur