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Ein neu entdeckter Weg der Reparatur hydrolytisch geschädigter DNA-Cytosinreste, etabliert im thermophilen Archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH

dc.contributor.advisorFritz, Hans-Joachim Prof. Dr.de
dc.contributor.authorSchomacher, Larsde
dc.date.accessioned2013-01-31T07:58:48Zde
dc.date.available2013-01-31T07:58:48Zde
dc.date.issued2007-11-21de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F230-Fde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3613
dc.description.abstractDie DNA-Basen Cytosin, Adenin und Guanin können an den exozyklischen Aminogrupen durch Hydrolyse spontan desaminiert werden. Die Cytosin-Desaminierung führt zur RNA-Base Uracil und ist von besonderer mutagener Bedeutung, da sie (i), relativ zur Desaminierung anderer Basen, häufig stattfindet und (ii) unrepariert zu C/G- nach T/A-Transitionsmutationen in der Hälfte der Nachkommenschaft einer Zelle führt. Die Initiation einer vom Sequenzkontext unabhängigen (generellen) Reparatur von Uracilresten in DNA war bislang allein auf Uracil-DNA-Glykosylasen zurückzuführen. Diese Enzyme leiten einen weit verbreiteten Mechanismus der DNA-Reparatur, die Basen-Exzisions-Reparatur, ein. Bei einigen Organismen ist jedoch bislang keine generelle Uracil-DNA-Glykosylase entdeckt worden. DNA thermophiler Organismen ist aus fundamentalen Gründen einem erhöhten Risiko an Mutationen ausgesetzt. Aus diesem Grund ist es erstaunlich, dass beim thermophilen Archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH bislang keine generell agierende Uracil-DNA-Glykosylase entdeckt worden ist. In vorliegender Arbeit konnte nach Fraktionierung einer Zellmasse vonM. thermautotrophicus ΔH eine Uracil prozessierende Aktivität nachgewiesen werden. Bei dieser Aktivität handelte es sich nicht um eine Glykosylase-, sondern eine Endonuklease-Aktivität an Uridinresten in DNA. Über massenspektrometrische Analyse, Selektion und Überprüfung geeigneter Kandidaten, konnte dem Genprodukt des Leserahmens mth212 diese Aktivität zugeordnet werden. Das Enzym, das bisher nur als Homolog der ExoIII-Familie von AP-Endonukleasen beschrieben worden war, ist zusätzlich zu den bekannten Aktivitäten von ExoIII-Enzymen in der Lage, Strangbrüche auf der 5‘ Seite eines Uridinrestes in doppelsträngiger DNA unabhängig vom gegenüberliegenden Nukleotid und unabhängig vom Sequenzkontext zu setzen. Durch diesen Strangbruch werden 3‘-OH und 5‘-Phosphat-Termini von dem Enzym erzeugt. Mit einem Proteinextrakt von M. thermautotrophicus ΔH wurde eine effiziente Reparatur einer U/G-Fehlpaarung (dem Produkt der Cytosin-Desaminierung in doppelsträngiger DNA) beobachtet. Die Initiation dieser Reparatur konnte über gezielte Adsorbtion von Mth212 an eine anti-Mth212-Antikörpermatrix fast vollständig verhindert werden. Die Reparatur der Fehlpaarung wurde demnach durch die neu entdeckte DNA-Uridin-Endonuklease eingeleitet. Die Enzyme DNA-Uridin-Endonuklease (Mth212), DNA-Polymerase B, 5‘ Flap-Endonuklease und DNA-Ligase aus M. thermautotrophicus ΔH wurden heterolog in E. coli produziert, bis nahe an die Homogenität gereinigt und die enzymatischen Aktivitäten in Einzelnachweisen bestätigt. Eine Rekonstitution der DNA-Uridin-Reparatur konnte mit diesem Satz an Enzymen durchgeführt werden. Dabei war jedoch der Anteil an ligierten Reparaturintermediaten (vollständige Reparatur) nur zu einem deutlich geringeren Anteil als mit dem Proteinextrakt detektierbar. Das könnte an der Auswahl bestimmter Enzyme, vor allem der DNA Polymerase, oder an einem Fehlen von Reparaturfaktoren gelegen haben.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleEin neu entdeckter Weg der Reparatur hydrolytisch geschädigter DNA-Cytosinreste, etabliert im thermophilen Archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔHde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedA new discovered repair mechanism for hydrolytically damaged DNA cytosine residues, established in the thermophilic archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔHde
dc.contributor.refereeKramer, Wilfried PD Dr.de
dc.date.examination2007-11-01de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.subject.gokWJL 100de
dc.description.abstractengThe DNA bases cytosine, adenine and guanine can be deaminated at the exocyclic aminogroups by spontaneous hydrolysis. Cytosine deamination leads to the RNA base uracil and is of particular mutagenic relevance, because it (i) occurs often compared with the deamination of the other bases and (ii) leads if unrepaired to a C/G to T/A transition mutation in half of the progeny of a cell. The initiation of a sequence context independent (general) repair of uracil residues in DNA was so far attributed to uracil DNA glycosylases solely. These enzymes initiate a common mechanism of DNA repair, base excision repair. However, a general uracil DNA glycosylase was not discovered in some organisms so far. DNA of thermophilic organisms is exposed to a higher risk of mutations due to fundamental reasons. From that point of view it’s astonishing that no general acting uracil DNA glycosylase was detected in the thermophilic archaeon Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH until now. In the present work a uracil processing activity could be demonstrated after fractionating a cell mass fromM. thermautotrophicus ΔH. This activity was not due to a glycosylase but an endonuclease activity at uridine residues in DNA. Via mass spectrometry analysis, selection and inspection of adequate candidates it was possible to associate the activity with the gene product of the open reading frame mth212. The protein was so far characterized as a homologous enzyme of the ExoIII family of AP endonucleases. In addition to the known activities of ExoIII enzymes it has the ability to set strand breaks at the 5’-site of uridine residues in double stranded DNA independent of the opposing nucleotide and independent of the sequence context. By this strand break the enzyme creates 3’-OH and 5’-phosphate termini. An efficient repair of a U/G mismatch (the product of cytosine deamination in double stranded DNA) was detected with a protein extract from M. thermautotrophicus ΔH. Initiation of this repair was almost completely inhibited via specific adsorption of Mth212 to an anti-Mth212 antibody matrix. According to this the repair of the mismatch was initiated by the newly discovered DNA uridine endonuclease. The enzymes DNA uridine endonuclease (Mth212), DNA polymerase B, 5’-flap endonuclease and DNA ligase from M. thermautotrophicus ΔH were produced heterologous in E. coli, purified to near homogeneity and tested for their enzymatic activities in individual confirmations. It was possible to arrange a reconstitution of DNA uridine repair with this set of enzymes. However, the fraction of ligated repair intermediates (complete repair) was detected in a considerable less proportion as with the protein extract. This could be due to the choice of enzymes, especially the DNA polymerase, or the absence of repair factors.de
dc.contributor.coRefereeBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Natural Sciencede
dc.subject.gerCytosin-Desaminerungde
dc.subject.gerthermophiles Archaeonde
dc.subject.gerUridin-Endonukleasede
dc.subject.gerUridin-Reparaturde
dc.subject.engcytosine deaminationde
dc.subject.engthermophilic archaeonde
dc.subject.enguridin endonucleasede
dc.subject.enguridine repairde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1629-6de
dc.identifier.purlwebdoc-1629de
dc.identifier.ppn587186127de


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