Growth, fruiting body development and laccase production of selected coprini
Navarro González, Mónica
von Mónica Navarro González
Datum der mündl. Prüfung:2008-04-30
Erschienen:2008-11-26
Betreuer:Prof. Dr. Gerhard Braus
Gutachter:Prof. Dr. Andrea Polle
Gutachter:Prof. Dr. Ursula Kües
Gutachter:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The coprini are a form group of mushrooms that grow mainly on compost and horse dung and that for over 100 years were thought to present one genus. Only in 2001 it was discovered by Redhead and coworkers by molecular analysis that the traditional genus comprises species of 4 different genera: Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus and Parasola. Several species of the traditional genus, amongst the basidiomycete model species Coprinopsis cinerea (formerly Coprinus cinereus), found previously attention for mushroom development by the ease to grow and fruit the fungi in culture. Surprisingly therefore, not even the pathway of fruiting body development for the model species C. cinerea was well presented in all different developmental stages in the literature. A task in this study was therefore to establish a picture catalogue of the events in the course of fruiting body development, up to fruiting body maturation and subsequent rapid autolysis of the mushrooms, a feature that is specific for many species of the coprini. Due to this autolysis, mushroom of coprini have so far made little use of e.g. for medicinal purposes. A literature compilation in medical and pharmaceutical compounds shows however that coprini have a potential for such applications. C. cinerea mycelia cultures attract mites that graze on the mycelium of the fungus. Upon an unintended infection of a culture by mites of the species Tyrophagus putrescentiae, the chance was taken to observe the behavior of the two species with each other. The mites were found to consume, albeit at different rates, mycelium of monokaryons and dikaryons including asexual spores (oidia) in the aerial mycelia. Furthermore, the animals consume cap tissues of fruiting bodies together with basidiospores but they leave the stipes aside. Basidiospores are ingested but not digested. They are excreted in compact faecal pellets. Basidiospores can still germinate after passing the gut of the mites. Since there are about 400 spores in a faecal pellet, mycelia of all mating types will arise and upon germination directly mate giving rise to dikaryons able to fruit. Dikaryon formation between germinated siblings promotes inbreeding in a fungus that naturally is an outbreeding organism. Thus, mites clearly affect the fungal life cycle. In turn, the fungus also influences the mites. Eggs are laid by the mites next to the faecal spore pellets. When the larvae hatch after about 5 days, the germinated mycelium will have obtained already a considerable colony size, presenting food for the young mites. Fruiting body development in the laboratory is not restricted to C. cinerea. In this thesis, fruiting body development was also followed up in Coprinopsis clastophylla and a species related to Coprinellus curtus, initiated by the observation that these species form unusual shaped mushrooms. Sometimes the structures are fully sterile, not forming basidiospores. The obtained fruiting body like structures are considered as anamorphs producing special mitotic cells (bulbils, lysomeres, or spherocytes) for vegetative reproduction. Molecular analysis of ITS sequences confirm that the strains described in the literature as anamorph Rhacophyllus lilacinus belongs to the genus Coprinopsis and the species C. clastophylla (Coprinus clastophyllus). Other strains with unusual shaped mushrooms were assigned by ITS sequences to the genus Coprinellus to a species closely related to C. curtus. Morphologically, the mushrooms of this unidentified species are not distinguishable from mushroom descriptions of Coprinopsis stercorea. Orton and Watling (1979) described C. stercorea to be heterothallic. Our isolate however is homothallic. This difference in the breeding systems can explain contradictory reports on C. stercorea in earlier literature on occurrence of homothallism and heterothallism in the species. Another reason to study C. clastophylla in this thesis was because of reports on the fungus in the literature as growing on wood. Also other species of the coprini were said to grow on wood, but a systematic study so far was not available. Therefore, all available literature on coprini on wood was collected and analyzed. It was found that about 30% of species in the new genera (Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus and Parasola) have been observed on wood, suggesting that the ability of the fungi to grow on wood was more extended amongst these fungi than formerly thought. Attempts were undertaken with collections o f coprini to grow the fungi on lignocellulosic material including wood (poplar, beech), wheat straw and oak and maple leave litter. Prior to the growth test, species identity was controlled by analysis of ITS sequences. It was found that several isolates were assigned to wrong coprini species, and in one case even to a wrong genus indicating the difficulty of morphological identification of coprini. Several of the tested strains identified to the species Coprinus comatus, Coprinopsis strossmayeri, Coprinellus curtus, Coprinellus micaceus, Coprinellus radians, Coprinellus xanthothrix, and 2 unidentified Coprinellus species, grow on wood and straw, but degradation of lignocellulose by these species appears not to be considerable. Probably, the fungi rather grow on the storage material present in the parenchymatic cells of the wood and straw. On leave litter, growth occurred only in exceptional cases, suggesting that phenolic compounds in the fallen leaves inhibit fungal growth and/or that the leaves do not contain easily accessible nutrients. To further get insight into the ability of the species to degrade lignocellulose, phenoloxidase activities and in particular laccase activities of the strains were tested. At least on straw, most strains had visible enzymatic activities. Participation of these enzymes in substrate degradation has to be studied further in the future. Laccase activity had also been connected in the past to fruiting body development. Therefore, laccase activity and laccase gene expression was followed up during growth and development in C. cinerea. Activity of gene transcription and enzymatic activity was highest in the later stages of fruiting body development (primordia, karyogamy, meiosis and basidiospore formation, and in maturation and autolysis of the fruiting bodies). Laccases were found to be induced by addition of copper in the medium but induction levels were relatively low. The result suggests that in this fungus laccases have rather developmental functions, such as in pigment formation, than functions in substrate utilization. Copper addition had further surprising effects on fruiting body development of the species. Fruiting was induced at the unusual temperature of 37°C together with nitrate reductase activity at a stage when the fungus actively increased the pH of the medium by ammonium production. Since nitrite reductase activity was not found, it is unlikely that ammonium secretion is due to combined actions of nitrate and nitrite reductases.
Keywords: Coprinus; Coprinopsis; Coprinellus; Parasola; Inkcap mushrooms; Coprinopsis cinerea; Coprinus cinereus; Coprini; Fruiting body development; Coprinoid mushrooms; Anamorph; etiolated stipes; Phenoloxidase; Laccase; Copper; Laccase gene expression; Mites; Tyrophagus putrescentiae
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Coprini sind eine Gruppe von Pilzen, die
meist auf Kompost und Pferdemist wachsen und mehr als 100 Jahre in
einer einzigen Gattung zusammengefasst waren. Erst im Jahr 2001
wurde von Redhead und Mitarbeitern entdeckt, dass die Gattung aus
vier unterschiedlichen Gattungen: Coprinus, Coprinopsis,
Coprinellus undParasola besteht. Einige Arten aus dieser Gattung,
darunter der Modellorganismus für Basidiomyzeten Coprinopsis
cinerea (früher Coprinus cinereus), wurden bereits zuvor zur
Untersuchung der Fruchtkörperentwicklung verwendet, weil sie leicht
im Labor anzuziehen sind und Fruchtkörper bilden. Somit überrascht,
dass die Fruchtkörperentwicklung von C. cinerea bisher nicht
vollständing in der Literatur beschrieben wurde. Eine Aufgabe
dieser Arbeit war es deshalb einen Bildkatalog mit allen wichtigen
Entwicklungsphasen bis zur Fruchtkörperreifung und Autolyse zu
erstellen. Ein Merkmal für einige Pilze aus dieser Gattung ist die
schnelle Zersetzung, weswegen die Fruchtkörper z.B. für
medizinische Anwendung wenig attraktiv sind. Eine
Literaturrecherche zu medizinischen und pharmazeutischen
Inhaltsstoffen belegt jedoch das große Potential der Coprini für
die Isolierung von pharmazeutisch relevanten Verbindungen.
Weiterhin locken C. cinerea Kulturen Milben an. Nach einer
unerwünschten Infektion von Pilzkulturen mit der Milbe Tyrophagus
putrescentiae wurde die Gelegenheit genutzt, die Wechselwirkung
zwischen diesen beiden Arten zu untersuchen. Die Milben ernährten
sich sowohl von dem Myzel der Monokaryonten als auch von dem der
Dikaryonten inklusive der asexuellen Sporen (Oidien), allerdings in
unterschiedlichem Maße. Außerdem wurde auch Hutgewebe aus den
Fruchtkörpern zusammen mit den Basidiosporen gefressen, der Stiel
blieb unangetastet. Die Basidiosporen wurden zwar gefressen,
allerdings nicht verdaut. Sie werden später mit dem Milbenkot
ausgeschieden. Solche Sporen waren noch in der Lage zu keimen. Aus
den circa 400 Sporen pro Milbenkotpellet wächst zunächst Myzel
aller Kreuzungstypen, was eine Kreuzung direkt nach der Keimung
ermöglicht. Das so entstehende Dikaryon kann wieder fruktifizieren.
Die Dikaryonbildung zwischen Geschwistern fördert Inzucht bei einem
Pilz, der normalerweise ein „Outbreeding“-Organismus ist. Auf diese
Weise, können die Milben den Pilz beeinflussen. Der Pilz hingegen
beinflusst die Milben dadurch, dass die Milbeneier neben dem
Milbenkot abgelegt werden. Die Larven schlüpfen nach ungefähr fünf
Tagen und ernähren sich von dem Myzel, das bereits aus dem Kot
gekeimt ist. Fruchtkörperentwicklung unter Laborbedingungen ist
nicht auf C. cinerea beschränkt. Auch bei Coprinopsis clastophylla
und einer mit Coprinellus curtus verwandten Art wurde die
Fruchtkörperentwicklung beobachtet. Diese Arten produzierten
ungewöhnliche Formen, und die Fruchtkörper waren zum Teil
unfruchtbar. Solche Fruchtkörperformen, sogenannte Anamorphe,
produzieren besondere mitotische Zellen (Bulbillen, Lysomere, oder
Sphärocysten) für die vegetative Vermehrung. ITS-Analysen zeigten,
dass die in der Literatur als anamorph beschriebenen Stämme
Rhacophyllus lilacinus zu der Gattung Coprinopsis und zu der Art C.
clastophylla (Coprinus clastophyllus) gehören. Andere Stämme mit
ungewöhnlichen Pilzformen wurden durch ITS-Analysen der Gattung
Coprinellus, verwandt mit C. curtus, zugeordnet. Morphologisch sind
Pilze dieser nicht identifizierten Art nicht von Pilzen, die der
Beschreibungen von Coprinopsis stercorea entsprechen, zu
unterscheiden. Orton und Watling (1979) beschrieben C. stercorea
als heterothallisch. Unser Stamm ist jedoch homothallisch. Dieser
Unterschied in den Kreuzungssystemen könnte gegensätztliche
Berichte von homothallischen und heterothallischen Formen von C.
stercorea in der Literatur erklären. Berichte aus der Literatur
zeigen, dass C. clastophylla auf Holz wächst, was ein weiterer
Grund war, sich in dieser Arbeit mit dieser Pilzart zu
beschäftigen. Von anderen Coprini ist bekannt, dass sie auf Holz
wachsen, allerdings gibt es zurzeit keine systematische Studie. Aus
diesem Grund, wurde sämtliche verfügbare Literatur über Coprini auf
Holz gesammelt und ausgewertet. So stellte sich heraus, dass
ungefähr 30% der Arten aus den neuen Gattungen (Coprinus,
Coprinopsis, Coprinellus und Parasola) auf Holz beobachtet wurden.
Solche Beobachtungen deuten darauf hin, dass Coprini auf Holz gut
wachsen können. Anzuchtversuche mit Coprinisammlungen auf
lignocellulotischen Substraten (Pappel, Buche), Weizenstroh sowie
Eichen- und Ahornblättern wurden durchgeführt. Die Identität dieser
Arten wurde mittels ITS-Analysen ermittelt. So stellte sich heraus,
dass einige Isolate zuvor falschen Copriniarten zugeordnet wurden,
in einem Fall sogar der falschen Gattung. Das zeigt, wie schwierig
es ist, aus morphologischen Merkmalen eine Art zu identifizieren.
Einige der untersuchten Stämme gehörten zu den Arten Coprinus
comatus, Coprinopsis strossmayeri, Coprinellus curtus, Coprinellus
micaceus, Coprinellus radians, Coprinellus xanthothrix. Diese
wuchsen auf Holz und Stroh, ebenso wie zwei unbekannte Coprinellus
Arten. Allerdings scheint der Abbau von Lignocellulose nicht in
nennenswertem Ausmaß zu erfolgen. Wahrscheinlich wachsen die Pilze
auf Speicherstoffen aus den parenchymatischen Zellen von Holz und
Stroh. Wachstum auf Blättern wurde selten beobachtet, vermutlich
weil Phenole aus den Blättern das Pilzwachstum hemmen oder weil
Blätter nicht genug leicht verfügbare Nährstoffe enthalten.
Zusätzlich wurden die Stämme auf ihre Phenoloxidaseproduktion
getestet, insbesondere auf die Laccaseproduktion. Die Stämme
konnten diese Enzyme zumindest auf Stroh produzieren. Dennoch sind
weitere Untersuchungen notwendig. Der Laccaseaktivität wurde schon
früher eine wichtige Rolle bei der Fruchtkörperentwicklung
zugeschrieben. Deshalb wurde die Laccaseaktivität und die
Laccasegenexpression während der Fruchtkörperentwicklung von C.
cinerea untersucht. Die Gentranskription und die enzymatische
Aktivität waren in den letzten Phasen der Fruchtkörperentwicklung
(Primordia, Karyogamy, Meiose und Basidiospore Bildung, und Reifung
und Autolyse) am höchsten. Obwohl Laccasen mit Kupfer induziert
wurden, war die Aktivität auf dem Medium sehr gering. Die
Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Enzyme eher eine Rolle bei
der Entwicklung, z.B. bei der Pigmentenbildung, spielen als bei der
Nährstoffnutzung. Kupferzugabe hatte starken Einfluss auf die
Fruchtkörperentwicklung. Obwohl sonst bei 37°C keine
Fruchtkörperbildung stattfindet, wurde diese durch Kupferzugabe
induziert. Dies war verbunden mit erhöhter
Nitratereduktase-Aktivität und gleichzeitig erhöhtem pH-Wert durch
Ammoniumproduktion. Da keine Nitritreduktase-Aktivität nachgewiesen
wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die Ammoniumproduktion auf
einer Kombination von Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität
beruht.
Schlagwörter: Coprinus; Coprinopsis; Coprinellus; Parasola; Tintlingsartige; Coprinopsis cinerea; Coprinus cinereus; Coprini; Fruchtkörperentwicklung; Coprinoid Pilze; Anamorph; Phenoloxidase; Laccase; Kupfer; Laccasegenexpression; Milben; Tyrophagus putrescentiae