Growth, fruiting body development and laccase production of selected coprini

Abstract

Coprini sind eine Gruppe von Pilzen, die meist auf Kompost und Pferdemist wachsen und mehr als 100 Jahre in einer einzigen Gattung zusammengefasst waren. Erst im Jahr 2001 wurde von Redhead und Mitarbeitern entdeckt, dass die Gattung aus vier unterschiedlichen Gattungen: Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus undParasola besteht. Einige Arten aus dieser Gattung, darunter der Modellorganismus für Basidiomyzeten Coprinopsis cinerea (früher Coprinus cinereus), wurden bereits zuvor zur Untersuchung der Fruchtkörperentwicklung verwendet, weil sie leicht im Labor anzuziehen sind und Fruchtkörper bilden. Somit überrascht, dass die Fruchtkörperentwicklung von C. cinerea bisher nicht vollständing in der Literatur beschrieben wurde. Eine Aufgabe dieser Arbeit war es deshalb einen Bildkatalog mit allen wichtigen Entwicklungsphasen bis zur Fruchtkörperreifung und Autolyse zu erstellen. Ein Merkmal für einige Pilze aus dieser Gattung ist die schnelle Zersetzung, weswegen die Fruchtkörper z.B. für medizinische Anwendung wenig attraktiv sind. Eine Literaturrecherche zu medizinischen und pharmazeutischen Inhaltsstoffen belegt jedoch das große Potential der Coprini für die Isolierung von pharmazeutisch relevanten Verbindungen. Weiterhin locken C. cinerea Kulturen Milben an. Nach einer unerwünschten Infektion von Pilzkulturen mit der Milbe Tyrophagus putrescentiae wurde die Gelegenheit genutzt, die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Arten zu untersuchen. Die Milben ernährten sich sowohl von dem Myzel der Monokaryonten als auch von dem der Dikaryonten inklusive der asexuellen Sporen (Oidien), allerdings in unterschiedlichem Maße. Außerdem wurde auch Hutgewebe aus den Fruchtkörpern zusammen mit den Basidiosporen gefressen, der Stiel blieb unangetastet. Die Basidiosporen wurden zwar gefressen, allerdings nicht verdaut. Sie werden später mit dem Milbenkot ausgeschieden. Solche Sporen waren noch in der Lage zu keimen. Aus den circa 400 Sporen pro Milbenkotpellet wächst zunächst Myzel aller Kreuzungstypen, was eine Kreuzung direkt nach der Keimung ermöglicht. Das so entstehende Dikaryon kann wieder fruktifizieren. Die Dikaryonbildung zwischen Geschwistern fördert Inzucht bei einem Pilz, der normalerweise ein „Outbreeding“-Organismus ist. Auf diese Weise, können die Milben den Pilz beeinflussen. Der Pilz hingegen beinflusst die Milben dadurch, dass die Milbeneier neben dem Milbenkot abgelegt werden. Die Larven schlüpfen nach ungefähr fünf Tagen und ernähren sich von dem Myzel, das bereits aus dem Kot gekeimt ist. Fruchtkörperentwicklung unter Laborbedingungen ist nicht auf C. cinerea beschränkt. Auch bei Coprinopsis clastophylla und einer mit Coprinellus curtus verwandten Art wurde die Fruchtkörperentwicklung beobachtet. Diese Arten produzierten ungewöhnliche Formen, und die Fruchtkörper waren zum Teil unfruchtbar. Solche Fruchtkörperformen, sogenannte Anamorphe, produzieren besondere mitotische Zellen (Bulbillen, Lysomere, oder Sphärocysten) für die vegetative Vermehrung. ITS-Analysen zeigten, dass die in der Literatur als anamorph beschriebenen Stämme Rhacophyllus lilacinus zu der Gattung Coprinopsis und zu der Art C. clastophylla (Coprinus clastophyllus) gehören. Andere Stämme mit ungewöhnlichen Pilzformen wurden durch ITS-Analysen der Gattung Coprinellus, verwandt mit C. curtus, zugeordnet. Morphologisch sind Pilze dieser nicht identifizierten Art nicht von Pilzen, die der Beschreibungen von Coprinopsis stercorea entsprechen, zu unterscheiden. Orton und Watling (1979) beschrieben C. stercorea als heterothallisch. Unser Stamm ist jedoch homothallisch. Dieser Unterschied in den Kreuzungssystemen könnte gegensätztliche Berichte von homothallischen und heterothallischen Formen von C. stercorea in der Literatur erklären. Berichte aus der Literatur zeigen, dass C. clastophylla auf Holz wächst, was ein weiterer Grund war, sich in dieser Arbeit mit dieser Pilzart zu beschäftigen. Von anderen Coprini ist bekannt, dass sie auf Holz wachsen, allerdings gibt es zurzeit keine systematische Studie. Aus diesem Grund, wurde sämtliche verfügbare Literatur über Coprini auf Holz gesammelt und ausgewertet. So stellte sich heraus, dass ungefähr 30% der Arten aus den neuen Gattungen (Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus und Parasola) auf Holz beobachtet wurden. Solche Beobachtungen deuten darauf hin, dass Coprini auf Holz gut wachsen können. Anzuchtversuche mit Coprinisammlungen auf lignocellulotischen Substraten (Pappel, Buche), Weizenstroh sowie Eichen- und Ahornblättern wurden durchgeführt. Die Identität dieser Arten wurde mittels ITS-Analysen ermittelt. So stellte sich heraus, dass einige Isolate zuvor falschen Copriniarten zugeordnet wurden, in einem Fall sogar der falschen Gattung. Das zeigt, wie schwierig es ist, aus morphologischen Merkmalen eine Art zu identifizieren. Einige der untersuchten Stämme gehörten zu den Arten Coprinus comatus, Coprinopsis strossmayeri, Coprinellus curtus, Coprinellus micaceus, Coprinellus radians, Coprinellus xanthothrix. Diese wuchsen auf Holz und Stroh, ebenso wie zwei unbekannte Coprinellus Arten. Allerdings scheint der Abbau von Lignocellulose nicht in nennenswertem Ausmaß zu erfolgen. Wahrscheinlich wachsen die Pilze auf Speicherstoffen aus den parenchymatischen Zellen von Holz und Stroh. Wachstum auf Blättern wurde selten beobachtet, vermutlich weil Phenole aus den Blättern das Pilzwachstum hemmen oder weil Blätter nicht genug leicht verfügbare Nährstoffe enthalten. Zusätzlich wurden die Stämme auf ihre Phenoloxidaseproduktion getestet, insbesondere auf die Laccaseproduktion. Die Stämme konnten diese Enzyme zumindest auf Stroh produzieren. Dennoch sind weitere Untersuchungen notwendig. Der Laccaseaktivität wurde schon früher eine wichtige Rolle bei der Fruchtkörperentwicklung zugeschrieben. Deshalb wurde die Laccaseaktivität und die Laccasegenexpression während der Fruchtkörperentwicklung von C. cinerea untersucht. Die Gentranskription und die enzymatische Aktivität waren in den letzten Phasen der Fruchtkörperentwicklung (Primordia, Karyogamy, Meiose und Basidiospore Bildung, und Reifung und Autolyse) am höchsten. Obwohl Laccasen mit Kupfer induziert wurden, war die Aktivität auf dem Medium sehr gering. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Enzyme eher eine Rolle bei der Entwicklung, z.B. bei der Pigmentenbildung, spielen als bei der Nährstoffnutzung. Kupferzugabe hatte starken Einfluss auf die Fruchtkörperentwicklung. Obwohl sonst bei 37°C keine Fruchtkörperbildung stattfindet, wurde diese durch Kupferzugabe induziert. Dies war verbunden mit erhöhter Nitratereduktase-Aktivität und gleichzeitig erhöhtem pH-Wert durch Ammoniumproduktion. Da keine Nitritreduktase-Aktivität nachgewiesen wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die Ammoniumproduktion auf einer Kombination von Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität beruht.