The role of Lissencephaly-1 protein in male germ cell differentiation
Über die Funktion des Lissencephaly-1 Proteins in der männlichen Keimzelldifferenzierung
von Nadja Drusenheimer
Datum der mündl. Prüfung:2009-07-01
Erschienen:2009-07-24
Betreuer:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
In the present study the function of Lissencephaly-1 protein in male germ cell differentiation was analysed. A gene trap mouse model (L39) in which a gene trap vector had integrated in intron 2 of Lis1 gene resulted in male infertility of homozygous L39GT/GT mice (Nayernia et al., 2003) and was further analysed in this study. Moreover, to study the gene trap mutation on different genetic backgrounds, namely CD-1, FVB, C57BL and 129/Sv, incipient congenic animals were generated. No differences between homozygous animals of different genetic backgrounds were found. Therefore a genetic background effect could be excluded. To confirm that the infertility of L39GT/GT males is due to the gene trap integration in Lis1 gene locus and to gain further insights into the role and requirement of LIS1 in spermatogenesis, a transgenic rescue approach was used. Three transgenic lines were generated, which overexpress Lis1 under the control of testis specific promoters. The promoters used were (i) hEF-1α promoter, which is exclusively active in spermatogonial cells, (ii) PGK2 promoter, which is active in pachytene spermatocytes and following stages of spermatogenesis, and (iii) TNP2 promoter, which is active in round spermatids and following stages of spermatogenesis. Five hEF-1α-Lis1-c-myc Tag lines, three PGK2-Lis1-c-myc Tag lines and two TNP2-Lis1 (Lispi) lines were analysed. The expression of the transgene was confirmed by Northern blotting, Western blotting and immunohistochemical analysis. All transgenic lines were fertile and testis sections displayed no abnormalities in comparison with wild type animals. Also homozygous transgenic males (PGK2-Lis1-c-myc Tag and hEF-1α-Lis1-c-myc Tag) were fertile with no abnormalities in testis morphology. The overexpression of Lis1 in different germ cells had no influence on fertility of transgenic animals. Transgenic animals were mated with L39 mice to generate “rescued” L39GT/GT/Lis1Tpos males. Two lines of PGK2-Lis1-c-myc Tag mice (L3 and L9), two lines of hEF-1α-Lis1-c-myc Tag mice (L15 and L19) and one line of Lispi mice were used for the rescue experiment. The expression of LIS1 fusion protein was confirmed by Western blotting and immunohistochemical analysis. All “rescued” animals remained infertile. A detailed analysis of spermatogenesis defects in two ”rescued” lines (L39/L3 and L39/L15) in comparison to L39GT/GT males revealed no significant differences. Also the number of sperm cells in caudae epididymes of “rescued” males was as low as in L39GT/GT mice. Taken together, the overexpression of Lis1 could not rescue the infertility phenotype of homozygous gene trap males.
Keywords: Lis1; spermatogenesis; gene-trap; transgenic mice; genetic rescue
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In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des Lissencephaly-1 Proteins in der männlichen Keimzelldifferenzierung untersucht.
Männliche homozygote Mäuse der Gene-Trap-Linie L39, in der der Gene-Trap-Vektor in das Intron 2 des Lis1 Gens integriert ist, sind infertil (Nayernia et al., 2003) und wurden in dieser Arbeit detailliert untersucht. Außerdem wurde die Gene Trap Mutation in den genetischen Hintergründen CD-1, FVB, C57BL und 129/Sv untersucht. Ein genetischer Hintergrundeffekt konnte ausgeschlossen werden, da keine Unterschiede zwischen homozygoten Männchen der verschiedenen Hintergründe gefunden wurden.
Um zu bestätigen, dass die Infertilität der L39GT/GT Männchen an der Integration des Gene-Trap-Vektors in das Lis1 Gen liegt, und um weitere Erkenntnisse über die Funktion von LIS1 in der Spermatogenese von Mäusen zu gewinnen, wurde ein transgener „rescue“ Ansatz gewählt. Dafür wurden drei transgene Linien generiert, die Lis1 unter Kontrolle von Testis spezifischen Promotoren überexprimieren. Diese Promotoren sind (i) der hEF-1α Promotor, der ausschließlich in spermatogonialen Zellen aktiv ist, (ii) der PGK2 Promotor, der ausschließlich in Pachytän-Spermatozyten und folgenden Stadien der Spermatogenese aktiv ist, und (iii) der TNP2 Promotor, der in runden Spermatiden und folgenden Stadien aktiv ist. Fünf hEF-1α-Lis1-c-myc Tag Linien, drei PGK2-Lis1-c-myc Tag Linien und zwei TNP2-Lis1 (Lispi) Linien wurden analysiert. Die Expression des Trangens wurde mit Hilfe von Northern blotting, Western blotting und immunohistochemischen Analysen bestätigt. Alle transgenen Linien waren fertil und Testisschnitte zeigten keine Veränderungen im Vergleich zu Wildtypen. Auch homozygote transgene Tiere waren fertil ohne morphologische Auffälligkeit der Testisschnitte. Die Überexpression von Lis1 in verschiedenen Keimzellen hat keinen Einfluss auf die Fertilität der Tiere.
Transgene Tiere wurden mit L39 Mäusen verpaart um „rescued“ L39GT/GT/Lis1Tpos Männchen zu generieren. Zwei PGK2-Lis1-c-myc Tag Linien (L3 and L9), zwei hEF-1α-Lis1-c-myc Tag Linien (L15 and L19) und eine Lispi Linie wurden für das „rescue“ Experiment verwendet. Die Expression des Lis1-Fusionsproteins wurde mit Western blotting und immunohistochemischen Analysen bestätigt. Alle „rescued“ Tiere blieben infertil. Eine detaillierte Analyse der Spermatogenese-Defekte in zwei „rescued“ Linien (L39/L3 und L39/L15) im Vergleich zu L39GT/GT Männchen zeigte keinen signifikanten Unterschied. Auch die Anzahl der Spermien in Caudae epididymes der „rescued“ Männchen war genauso gering wie in L39GT/GT Männchen. Die Überexpression von Lis1 kann die Infertiliät der homozgoten Gene-Trap Männchen nicht heilen.
Schlagwörter: Lis1; Spermatogenese; Gene-Trap; transgene Mäuse