The role of Lissencephaly-1 protein in male germ cell differentiation

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des Lissencephaly-1 Proteins in der männlichen Keimzelldifferenzierung untersucht.

Männliche homozygote Mäuse der Gene-Trap-Linie L39, in der der Gene-Trap-Vektor in das Intron 2 des Lis1 Gens integriert ist, sind infertil (Nayernia et al., 2003) und wurden in dieser Arbeit detailliert untersucht. Außerdem wurde die Gene Trap Mutation in den genetischen Hintergründen CD-1, FVB, C57BL und 129/Sv untersucht. Ein genetischer Hintergrundeffekt konnte ausgeschlossen werden, da keine Unterschiede zwischen homozygoten Männchen der verschiedenen Hintergründe gefunden wurden.

Um zu bestätigen, dass die Infertilität der L39GT/GT Männchen an der Integration des Gene-Trap-Vektors in das Lis1 Gen liegt, und um weitere Erkenntnisse über die Funktion von LIS1 in der Spermatogenese von Mäusen zu gewinnen, wurde ein transgener „rescue“ Ansatz gewählt. Dafür wurden drei transgene Linien generiert, die Lis1 unter Kontrolle von Testis spezifischen Promotoren überexprimieren. Diese Promotoren sind (i) der hEF-1α Promotor, der ausschließlich in spermatogonialen Zellen aktiv ist, (ii) der PGK2 Promotor, der ausschließlich in Pachytän-Spermatozyten und folgenden Stadien der Spermatogenese aktiv ist, und (iii) der TNP2 Promotor, der in runden Spermatiden und folgenden Stadien aktiv ist. Fünf hEF-1α-Lis1-c-myc Tag Linien, drei PGK2-Lis1-c-myc Tag Linien und zwei TNP2-Lis1 (Lispi) Linien wurden analysiert. Die Expression des Trangens wurde mit Hilfe von Northern blotting, Western blotting und immunohistochemischen Analysen bestätigt. Alle transgenen Linien waren fertil und Testisschnitte zeigten keine Veränderungen im Vergleich zu Wildtypen. Auch homozygote transgene Tiere waren fertil ohne morphologische Auffälligkeit der Testisschnitte. Die Überexpression von Lis1 in verschiedenen Keimzellen hat keinen Einfluss auf die Fertilität der Tiere.

Transgene Tiere wurden mit L39 Mäusen verpaart um „rescued“ L39GT/GT/Lis1Tpos Männchen zu generieren. Zwei PGK2-Lis1-c-myc Tag Linien (L3 and L9), zwei hEF-1α-Lis1-c-myc Tag Linien (L15 and L19) und eine Lispi Linie wurden für das „rescue“ Experiment verwendet. Die Expression des Lis1-Fusionsproteins wurde mit Western blotting und immunohistochemischen Analysen bestätigt. Alle „rescued“ Tiere blieben infertil. Eine detaillierte Analyse der Spermatogenese-Defekte in zwei „rescued“ Linien (L39/L3 und L39/L15) im Vergleich zu L39GT/GT Männchen zeigte keinen signifikanten Unterschied. Auch die Anzahl der Spermien in Caudae epididymes der „rescued“ Männchen war genauso gering wie in L39GT/GT Männchen. Die Überexpression von Lis1 kann die Infertiliät der homozgoten Gene-Trap Männchen nicht heilen.