The timing of the final assembly of the SNARE complex in exocytosis

Abstract

Der Informationstransfer zwischen individuellen Neuronen mittels Exozytose bedarf der Fusion sekretorischer Vesikel mit der Plasmamembran und benötigt die Komplexbildung der SNARE Proteine Syntaxin-1, SNAP-25 und Synaptobervin 2. Obwohl der SNARE Komplex in in-vitro Systemen gründlich charakterisiert wurde, ist bisher nur wenig über den molekularen Mechanismus der Reaktion in vivo bekannt. Vor allem ist ungeklärt, welche Rolle die SNARE Proteine in Schritten spielen, die zum Erlangen der Fusionskompetenz sekretorischer Vesikel notwendig sind („docking“, „priming“) und wie genau die Bildung des Komplexes Fusion ermöglicht. In dieser Arbeit wurde die Rolle der SNARE Proteine und deren Bindungspartner in „docking“, „priming“ und der Fusion der Vesikel untersucht. Als Modellsystem erlaubt die Chromaffinzelle die Analyse der Rolle der einzelnen Proteine in den verschiedenen Stadien des Fusionsprozesses in „knockout“ Mäusen. Eine Reihe verschiedener Methoden wurde angewandt; sowohl Elektronenmikroskopie als auch elektrophysiologische Messungen und biochemische Analyse erlaubten die Analyse der einzelnen Reaktionsschritte und die Etablierung eines Reaktionsmodells. Es wurde festgestellt, dass SNAP-25, zusammen mit den bereits bekannten „docking“ Faktoren Syntaxin und Munc-18 für die „docking“ Reaktion essentiell ist. Die Rolle von Munc-18 in diesem Prozess könnte in der Stabilisierung einer Syntaxin:SNAP-25 „docking“-Plattform liegen, die die stabile Assoziation der Vesikel an der Freisetzungsstelle erlaubt. Zusätzlich ist Munc-18 jedoch wichtig für die folgende „priming“ Reaktion. Synaptotagmin-1 wurde erstmalig als vesikulärer „docking“-Faktor charakterisiert. Um den molekularen Mechanismus der SNARE-Komplexbildung in der Exozytose exakt zu beschreiben, wurde eine Mutagenesestudie durchgeführt. Mit der Absicht, den Komplex regional zu schwächen, wurden Punktmutationen des vesikulären SNARE Proteins Synaptobrevin 2 generiert und mit Hilfe viraler Expressionssysteme in „knockout“ Zellen phenotypologisch untersucht. Eine deutliche Regiosensitivität wurde gefunden: N-terminale (Membran distale) Destabilisierung verlangsamte in erster Linie die „priming“ Reaktion, wohingegen C-terminale (Membran proximale) Destabilisierung die Geschwindigkeit der Sekretion reduzierte und zusätzlich die Lebensdauer der Fusionspore verkürzte. Die gefundene Regiosensitivität stimmt mit einem Model überein, demzufolge N-terminale SNARE Interaktion für „priming“ wichtig ist und C-terminale Bindung Exozytose „triggert“ und die Fusionspore stabilisiert. Alles in allem erlauben die Daten die erstmalige Entwicklung eines Models der verschiedenen Schritte der vesikulären Freisetzungsmaschinerie in Chromaffinzellen in Bezug auf „docking“, „priming“ und Fusion.