Untersuchungen zur Wirksamkeit von Dacarbazin und Temozolomid bei der Behandlung des kutanen Melanoms in Assoziation mit DNA-Reparatur

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Untersuchung der Genexpression, Genvarianten und des Promotor-Methylierungsstatus der DNA-Reparaturgene MGMT, MLH1 und MSH2 in peripheren Blut-Lymphocyten von Melanom-Patienten, Tumor-unabhängige Marker für hämatologische Nebenwirkungen und Ansprechen einer Dacarbazin- oder Temozolomid-Therapie zu identifizieren. Solche Marker könnten die Entscheidung für oder gegen eine Therapie mit Dacarbazin oder Temozolomid erheblich erleichtern. Weiteres Ziel war es, durch Zellkultur-Experimente einen Beitrag zur Aufklärung der Wirk- und Resistenz-Mechanismen von Temozolomid auf Melanom-Zelllinien zu leisten. Im Zuge der Untersuchung von 51 kaukasischen Patienten mit metastasiertem Melanom konnte festgestellt werden, dass die gleichzeitig konstitutiv niedrige oder gleichzeitig konstitutiv hohe mRNA-Expression von MGMT, MLH1 und MSH2 mit reduzierten Nebenwirkungen einer Temozolomid-Therapie assoziiert ist, aber nicht mit dem Ansprechen auf die Therapie korreliert. Untersuchungen des Promotor-Methylierungsstatus von MGMT, MLH1 und MSH2 zeigten, dass Variationen der Genexpression nicht auf den Promotor-Methylierungsstatus zurückzuführen sind. Durch Sequenzierung des kodierenden Bereichs inklusive der Speißstellen konnten 5 genetische Varianten im MGMT-Gen, 13 im MLH1-Gen und 7 im MSH2-Gen identifiziert werden. Von den 13 identifizierten Varianten des MLH1-Gens waren 5 Varianten bisher nicht beschrieben. Bemerkenswert ist der Befund, dass die intronische Variante g.73170T>C des MSH2-Gens mit erhöhten hämatologischen Nebenwirkungen assoziiert ist und tendenziell auch mit dem Ansprechen korreliert. Im Rahmen von Zellkultur-Untersuchungen konnten Sensitivitätsunterschiede zwischen fünf Melanom-Zelllinien gegenüber Temozolomid mit Bezug auf zwei unterschiedliche Behandlungsschemata festgestellt werden. Überraschenderweise waren zwei der fünf Zelllinien sensitiver gegenüber der einmaligen Temozolomid-Behandlung im Vergleich zur fünfmaligen Temozolomid-Behandlung. Die Basis mRNA-Expression von MGMT, MLH1 und MSH2 korrelierte gut mit dem Promotor-Methylierungsstatus der Gene. MGMT wurde nur von einer Zelllinie exprimiert und auch nur in dieser Zelllinie lag die Promotor-Region nicht-methyliert vor. Nach Temozolomid-Behandlung konnte keine Veränderung der Expression der drei Gene beobachtet werden. Der Frage, ob Unterschiede in der Zellzyklus-Arretierung und der Apoptose die unterschiedlichen Sensitivitäten gegenüber Temozolomid bedingen, wurde durch Experimente zur Zellzyklusphasenverteilung und zur Apoptose-Induktion nachgegangen. Signifikante Unterschiede zwischen den Zelllinien, welche die differenten Sensitivitäten erklären würden, konnten nicht gefunden werden. Experimente zur Quantifizierung der O6-Methylguanin-Addukte konnten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zelllinien offenbaren. Die Ergebnisse deuten aber auf eine Abnahme der Reparaturkapazität nach wiederholter Temozolomid-Behandlung hin.