Analyse und Expression der Komplementproteine Faktor H und Faktor I der Ratte

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die zuvor nicht bekannte komplette cDNA-Sequenz des Ratten FH identifiziert. Zusätzlich wurden zwei verkürzte rekombinante Varianten des Ratten FH hergestellt. Eine bestand aus den ersten 7 SCR des FH und wurde in HEK293- und Mono-Mac-6-Säugerzellen exprimiert, die andere bestand aus den ersten 4 SCR des FH und wurde mit Hilfe des Baculovirussystems in SF21-Insektenzellen exprimiert. Beide rekombinanten Faktoren FH(SCR1-7) und FH(SCR1-4) zeigten eine Komplement-inhibitorische Wirkung im CH50-Hämolysetest und konnten damit als funktionell aktiv charakterisiert werden. Mit Hilfe des in dieser Arbeit hergestellten monoklonalen anti-FH Antikörpers (mAK 4-7D) konnte eine immunaffinitätschromatographische Aufreinigung des FH aus Rattenserum etabliert werden, die den Gesamt-FH(SCR1-20) im zweistelligen mg-Bereich für strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Verfügung stellte. In Verbindung mit dem ebenfalls neu generierten anti-FH IgG (polyklonaler Antikörper des Kaninchens) wurde für die Detektion und Quantifizierung des FH ein Sandwich-ELISA etabliert. Durch die bereits im Rahmen der eigenen Diplomarbeit („Induktion und Regulation des Komplementproteins Faktor I“) erfolgte Generierung eines monoklonalen anti-Ratten FI Antikörpers und die innerhalb dieser Arbeit zusätzlich erfolgte Herstellung eines polyklonalen anti-Ratten FI IgG (ebenfalls aus dem Kaninchen) wurden weitere Werkzeuge für die Detektion des FI im Immunblotverfahren geschaffen. Durch die Immobilisierung des anti-Ratten FI mAK15F11-2 an einer Matrix war es zusätzlich möglich, den Ratten FI in funktionell aktiver Form aus Serum zu isolieren. Die beiden mittels Immunaffinitätschromatographie aus Serum isolierten Faktoren H und I erwiesen sich wie auch die beiden rekombinanten FH-Varianten (SCR1-4 und SCR1-7) im CH50-Hämolysetest als aktive Proteine, so dass sie für weitere in vitro aber auch für geplante in vivo Experimente zur Verfügung stehen. Zusammenfassend sei festgestellt, dass mit dieser Arbeit eine breite Basis an Werkzeugen für die Detektion, Quantifizierung und strukturelle Untersuchung der Komplement-inhibitorischen Faktoren H und I der Ratte geschaffen wurde. Darüberhinaus stehen beide Faktoren in zur Homogenität aufgereinigter Form, der Faktor H zusätzlich in zwei rekombinanten Varianten (SCR1-4 und SCR1-7) funktionell aktiv für einen therapeutischen Einsatz in verschiedenen Krankheitsmodellen der Ratte zur Verfügung.