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Analyse und Expression der Komplementproteine Faktor H und Faktor I der Ratte

dc.contributor.advisorMayer, Frank Prof. Dr.de
dc.contributor.authorDemberg, Thorstende
dc.date.accessioned2013-01-31T08:18:01Zde
dc.date.available2013-01-31T08:18:01Zde
dc.date.issued2003-11-25de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F261-1de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3661
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3661
dc.description.abstractIn der vorliegenden Arbeit wurde die zuvor nicht bekannte komplette cDNA-Sequenz des Ratten FH identifiziert. Zusätzlich wurden zwei verkürzte rekombinante Varianten des Ratten FH hergestellt. Eine bestand aus den ersten 7 SCR des FH und wurde in HEK293- und Mono-Mac-6-Säugerzellen exprimiert, die andere bestand aus den ersten 4 SCR des FH und wurde mit Hilfe des Baculovirussystems in SF21-Insektenzellen exprimiert. Beide rekombinanten Faktoren FH(SCR1-7) und FH(SCR1-4) zeigten eine Komplement-inhibitorische Wirkung im CH50-Hämolysetest und konnten damit als funktionell aktiv charakterisiert werden. Mit Hilfe des in dieser Arbeit hergestellten monoklonalen anti-FH Antikörpers (mAK 4-7D) konnte eine immunaffinitätschromatographische Aufreinigung des FH aus Rattenserum etabliert werden, die den Gesamt-FH(SCR1-20) im zweistelligen mg-Bereich für strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Verfügung stellte. In Verbindung mit dem ebenfalls neu generierten anti-FH IgG (polyklonaler Antikörper des Kaninchens) wurde für die Detektion und Quantifizierung des FH ein Sandwich-ELISA etabliert. Durch die bereits im Rahmen der eigenen Diplomarbeit („Induktion und Regulation des Komplementproteins Faktor I“) erfolgte Generierung eines monoklonalen anti-Ratten FI Antikörpers und die innerhalb dieser Arbeit zusätzlich erfolgte Herstellung eines polyklonalen anti-Ratten FI IgG (ebenfalls aus dem Kaninchen) wurden weitere Werkzeuge für die Detektion des FI im Immunblotverfahren geschaffen. Durch die Immobilisierung des anti-Ratten FI mAK15F11-2 an einer Matrix war es zusätzlich möglich, den Ratten FI in funktionell aktiver Form aus Serum zu isolieren. Die beiden mittels Immunaffinitätschromatographie aus Serum isolierten Faktoren H und I erwiesen sich wie auch die beiden rekombinanten FH-Varianten (SCR1-4 und SCR1-7) im CH50-Hämolysetest als aktive Proteine, so dass sie für weitere in vitro aber auch für geplante in vivo Experimente zur Verfügung stehen. Zusammenfassend sei festgestellt, dass mit dieser Arbeit eine breite Basis an Werkzeugen für die Detektion, Quantifizierung und strukturelle Untersuchung der Komplement-inhibitorischen Faktoren H und I der Ratte geschaffen wurde. Darüberhinaus stehen beide Faktoren in zur Homogenität aufgereinigter Form, der Faktor H zusätzlich in zwei rekombinanten Varianten (SCR1-4 und SCR1-7) funktionell aktiv für einen therapeutischen Einsatz in verschiedenen Krankheitsmodellen der Ratte zur Verfügung.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleAnalyse und Expression der Komplementproteine Faktor H und Faktor I der Rattede
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedAnalysis and expression of the rat complement proteins factor H and factor Ide
dc.contributor.refereeMayer, Frank Prof. Dr.de
dc.date.examination2003-11-05de
dc.subject.dnb33 Medizinde
dc.subject.gokMde
dc.description.abstractengIn this thesis the previously unknown complete coding cDNA-sequence of rat complement protein factor H (FH) was revealed. In addition to the identification of the coding sequence two short variants of rat factor H were recombinantly expressed. The first recombinant rat FH protein consist of the first seven domains and was expressed in HEK293 and Mono-Mac-6 cells. The second variant consist of the first four domains and was recombinantly expressed in SF21-insect cells. Both proteins demonstrated a complement-inhibitory function in a CH50-hemolysis assay, which characterized them as fully functional proteins. With the new monoclonal antibody (mab 4-7D) it was possible to isolate the native FH protein (20 SCR) by immuno-affinity chromatography from rat serum. The purified FH was further functionally characterized. In combination with a rabbit anti-rat factor H polyclonal IgG it was possible to establish an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection and quantification of rat FH. The monoclonal anti-rat factor I (FI) antibody (mab 15F11-2) and the newly generated rabbit anti-rat FI polyclonal IgG were used for the detection of FI. The mab 15F11-2 was used to prepare an affinity matrix for the isolation of FI from rat serum. The isolated proteins, factor H and I, and the recombinantly expressed short versions of rat factor H were tested in diverse combinations in a CH50-hemolysis assay to investigate whether a synergistic effect between FH and FI existed. In summary, several tools for the detection, quantification and structural analysis of the complement inhibitory protein H and I were generated. After their purification to homogeneity both factors H and I as well as two recombinant variants of rat factor H (SCR1-4, SCR1-7) are now available for further studies of the pathological effects of the complement system in animal models.de
dc.contributor.coRefereeHardeland, Rüdiger Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeGötze, Otto Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Natural Sciencede
dc.subject.gerKomplementsystemde
dc.subject.gerKomplementregulatorende
dc.subject.gerKomplementinhibitorende
dc.subject.gerFaktor Hde
dc.subject.gerFaktor Ide
dc.subject.engComplementsystemde
dc.subject.engregulators of complementde
dc.subject.engcomplement-inhibitory-factorsde
dc.subject.engfactor Hde
dc.subject.engfactor Ide
dc.subject.bk44.45de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-408-2de
dc.identifier.purlwebdoc-408de
dc.identifier.ppn377342769de


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