In vitro studies of protein interactions on substrate supported artificial membranes
by Daniela Morick
Date of Examination:2013-01-23
Date of issue:2013-02-12
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Kai Tittmann
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3727
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Abstract
English
Protein interactions that take place at the interface of a membrane are abundant within cellular organisms. Hence, surface coupled protein interactions are a matter of ongoing scientific investigation. In this work, elected protein interactions were studied at the interface of artificial membranes, attempting to create model systems that would best mimic the natural protein environment. In the first part of this work (chapter 4-6), a quartz crystal microbalance (QCM) biosen-sor assay based on solid supported membranes (SSMs) was established to quantify the inter-action of C-terminal polycystin-2 (cPC2) with its putative interaction partners C-terminal polycystin-1 (cPC1) and PIGEA14. It was found that the affinity of cPC2 to cPC1 was three times higher in the presence of Ca2+, leading to the assumption that cPC2 forms trimers in the absence of Ca2+. Based on the observation that the kinetic rate constants are Ca2+ dependent, a binding model was developed that describes a three step cPC2 binding in the absence and a one step binding in the presence of Ca2+. Following a hypothesis that had been suggested earlier, the interaction of cPC2 with PIGEA14 was investigated as a function of cPC2 pseudophosphorylation at Ser812. It was found that the affinity of the pseudophosphorylated mutant cPC2S812D to PI-GEA14 was indeed reduced two fold compared to cPC2wt. The second part of the thesis (chapter 7 and 8) dealt with investigating the interaction of filamentous actin (F-actin) with SSMs and pore spanning membranes (PSMs) on po-rous aluminum or silicon nitride based surfaces by means of optical waveguide spec-troscopy (OWS) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Mimicking the struc-ture of cellular microvilli, specific F-actin adsorption within and atop porous anodic aluminum oxide (AAO) films could be controlled using different functionalization strategies. The impact of a membrane bound F-actin network on the tension and viscoelastic properties of PSMs was investigated by means of atomic force microscopy (AFM). While the membrane tension remained almost unaltered, the origination of a viscoelastic membrane properties was caused by the attached F-actin network.
Keywords: protein-protein interactions; artificial membranes; Polycystin-2; F-actin
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Da eine Vielzahl von Proteininteraktionen innerhalb zellulärer Organismen an der Grenzfläche zu Membranen stattfindet, ist die Untersuchung dieser Prozesse von gro-ßem wissenschaftlichem Interesse. Ziel dieser Arbeit war es Modellsysteme basierend auf artifiziellen Membranen zu entwickeln, mit deren Hilfe die Untersuchung ausge-wählter Proteininteraktionen ermöglicht werden konnte.
Im ersten Abschnitt dieser Arbeit (Kapitel 4-6) wurde ein Biosensorassay basierend auf festköperunterstützten Membranen entwickelt, der die Quantifizierung der Interaktion von C-Polycystin-2 (cPC2) mit seinen Interaktionspartnern C-Polycystin-1 (cPC1) und PIGEA14 mittels der Quarzmikrowaagetechnik ermöglichte. Aufgrund der Tatsache, dass die Affinität von cPC2 zu cPC1 in Anwesenheit von Ca2+ dreifach höher war, wurde eine Ca2+ abhängige Trimerisierung von cPC2 postuliert. Die Unterschiede der ermittelten kinetischen Koeffizienten führten zur Entwicklung eines Bindunsgmodells, welches die dreistufige Adsorption von cPC2 an cPC1 in Abwesenheit bzw. einstufige Adsorption in Anwesenheit von Ca2+ implizierte. Im Falle der Interaktion von cPC2 mit PIGEA14 wurde die Abhänigkeit der cPC2 Bindung von der Pseudophosphorylie-rung des Proteins an Ser812 untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Affinität der pseudophosphorylierten Mutante cPC2S812D zu PIGEA14 zweifach niedriger war, als die von cPC2wt.
Im zweiten Abschnitt der Arbeit (Kapitel 7 und 8) wurde die spezifische Wechselwir-kung von filamentösem Aktin (F-Aktin) mit festkörperunterstützten und porenüber-spannenden Membranen untersucht. Die kontrollierte Anbindung von F-Aktin in und auf porösen Aluminiumoxidfilmen konnte mit Hilfe verschiedener Funktionalisie-rungsstrategien erzielt werden. Der Einfluss eines F-Aktin Netzwerks auf die Span-nung und viskoelastischen Eigenschaften porenüberspannender Membranen wurde mittels kraftmikroskopischer Studien untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass der Einfluss von gebundenem F-Aktin auf die Membranspannung gering war, aber erst durch die F-Aktin Adhäsion viskoelastische Membraneigenschaften induziert wurden.