Analysis of coiled coil domain containing 33 protein (CCDC33) and determination of infertility causes in mutant mouse line with the deletion of six germ cell-specific genes

Abstract

Zusammenfassung

Da die meisten Fälle männlicher Unfruchtbarkeit immer noch idiopatisch bleiben, könnte eine Untersuchung der Mechanismen, in denen Gene der Spermatogenese-Kontrolle involviert sind, helfen, die Gründe besser zu verstehen. Diese Arbeit besteht aus zwei Teilen die zwei verschiedene Aspekte humaner Fertilitätsforschung betreffen. Das erste Projekt betrifft die Analyse des coiled coil domain containing 33 (CCDC33) Proteins und seiner Rolle als peroxisomal testis specific 1 (PXT1) Interaktionspartner. Im zweite Projekt haben wir die Ursache männlicher Unfruchtbarkeit in Mäusen mit multiplen knockouts bestimmt und den Phänotyp anlaysiert. Folgende Gene wurden ausgeknocked: Tnp2, Hist1h1t, Theg, Acr, Creb3l4 and Tex22. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Domänen, die bei der CCDC33 und PXT1-Interaktion beteilgt sind, identifiziert. Die Interaktion dieser beiden Proteine wurde duch Kaczmarek identifiziert (Kaczmarek, 2009). Wir zeigten, dass nicht die coiled coil Domänen für die Interaktion mit PXT1 verantwortlich sind, sondern eine Aminosäuresequenz welche der Sequenz in Leucin-reichen Domänen ähnlich ist. Durch induzierte Mutagenese in der PXT1-Sequenz haben wir Aminosäuresequenzen identifiziert, die für die Interaktion von PXT1 und CCDC33 bedeutend sind. PXT1 ist ein erstes peroxisomales Protein das eine funktionale BH3-ähnliche Domäne enthält, die dafür bekannt ist Apoptose zu induzieren. Aufgrund von Experimenten mit Co-transfizieretn HeLa Zellen konnten wir eine Co-Lokalisation von CCDC33 und PXT1 im Zytoplasma nachweisen. Zudem zeigten Zellen mit Co-Lokalisation beider Proteine eine Reduktion der Apoptoserate im Vergleich zu Zellen die nur mit dem PXT1-Konstrukt transfiziert waren. Dieser Befund könnte suggerieren, dass die physikalische Bindung beider Proteine die PXT1-induzierte Apoptose verhindert. Durch Western Blot und immunhistochemische Experimente konnten wir zeigen, dass das CCDC33 Protein in den Hoden während der Spermatogenese ab dem Spermatocyten- Stadium lokalisiert ist. Sowohl die Interaktion von CCDC33 und PXT1 als auch das Expressionsmuster beider Gene implizieren, dass Ccdc33 in der Kontrolle der Spermatogenese involiert sein könnte. Wir postulieren, dass CCDC33 ein neues peroxisomales Protein sein könnte, welches Apoptose während der Spermatogenes reguliert. Jedoch sind weitere Untersuchungen, u.a. die Analyse von CCDC33 knockout Maus-Modellen, nötig, um feststellen zu können ob Ccdc33 für die männliche Fertilität essentiell ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Analyse von knockout Mäuselinien, in denen 6 keimzellspezifische Gene funktionsunfähig gemacht wurden, beschrieben. In ca. 20% der Mäuse wurde Unfruchtbarkeit festgestellt. In beiden, männlichen fruchtbaren und unfruchtbaren 6xKO Mäusen, ist die Zahl an Spermatozoa mit abnormalen Kopf erhöht und Sperma-Motilität reduziert. Nach Kreuzung von weiblichen wildtyp Mäusen mit männlichen 6xKO Tieren, benötigte das Sperma bemerkenswert längere Zeit um die Oocyte zu befreuchten as im Vergleich zu WT Sperma. Die Unterschiede im Phänotyp der 6xKO Mäuse sind sowohl dem genetischen Hintergrund als auch der Inaktivierung der sechs keimzellspezifischen Gene zuzuschreiben. Um genauer zu untersuchen welche Gene bei der Unfruchhtbarkeit der 6xKO Mäuse involviert sein könnten haben wir ein Transkriptom Assay durchgeführt und die Genexpression in den Hoden von 5xKO Tieren, die fertil waren, mit der in 6xKO Mäusen, die infertil waren, verglichen. Wir haben ein neues Gen, 4933400A11Rik, identifiziert und charakterisiert, welches für die Unfruchtbarkeit männlicher 6xKO Mäuse verantwortlich sein könnte. In WT Mäusen ist 4933400A11Rik in den Keimzellen exprimiert. 4933400A11Rik mRNA wurde ab Tag 16 post partum, wenn primäre Spermatozyten produziert werden, bis zu den ausgewachsenen Spermien detektiert. Es ist jedoch nicht klar, ob die mRNA die in den Spermien entdeckt wurde ein Ergebniss der Expression von 4933400A11Rik sind, oder ob es sich dabei um restliche Moleküle handelt welche während der Spermatogenese nicht abgebaut wurden. 4933400A11RIK weist Sequenzähnlichkeiten zur Aktinfilament capping Proteinfamile auf. Wir zeigten, dass 4933400A11RIK mit F-Aktin capping Protein Untereinheit alpha-1 colokalisiert. Proteine dieser Familie sind bekannt dafür das Wachstum des Zytoskeletts durch Regulation der Aktinfilament-Reorganisation zu kontrollieren. Deregulation der Aktinzytoskelett-Reorganisation in Keimzellen könnte die zugrundeliegende Ursache der männlichen Unfruchtbarkeit in 6x KO Mäusen sein, denn 4933400A11Rik wird in den Hoden fertiler 6xKO Mäuse, aber nicht in den Hoden infertiler 6xKO Mäuse exprimiert. Um die Frage eindeutig zu beantworten, ob das Gen 4933400A11Rik die Fertilität beeinflusst, sollten 4933400A11Rik knockout Mäuse generiert und analysiert werden. Das ´Rescue-Experiment´ könnte ebenso die Involvierung dieses Gens bei männlichen Fertilität bestätigen. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit interessante Erkenntnisse über die potentielle Funktion von CCDC33 bei der Regulation der Spermatogenese. Außerdem zeigen wir kumulierte Effekte von 6 keimzellspezifischen Genen und einem neuen Gen, 4933400A11Rik, welches für die weitere Forschung männlicher Unfruchtbarkeit interessant sein könnte.