Functional analysis of Zfp819 in pluripotency and embryonic development

Abstract

Pluripotenz wird durch viele Stammzell-spezifische Transkriptionsfaktoren wie Oct3/4, Nanog und Sox2 sowie deren Funktion in ihrem regulatorischen Netzwerk etabliert und aufrechterhalten. Viele Studien haben gezeigt, wie diese Pluripotenz-assoziierten Faktoren ihre Zielgene regulieren. Dies geschieht durch die Interaktion mit bekannten und unbekannten Interaktionspartnern. In der vorliegenden Arbeit haben wir Zfp819 als einen neuen Pluripotenz-assoziierten Faktor beschrieben und dessen Funktion in pluripotenten Stammzellen untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit haben wir zwei cDNA-Banken für Yeast two Hybdrid (Y2H)-Assays aus unterschiedlichen pluripotenten Stammzelltypen generiert. Dies hatte zum Ziel, potentielle Interaktionspartner eines Kandidatenproteins zu identifizieren um dadurch Eindrücke über die Funktion des Proteins zu gewinnen. Für die Identifizierung von potentiellen Interaktionspartnern von Zfp819 haben wir die cDNA-Bank aus embryonalen Stammzellen benutzt. Wir konnten 17 putative Interaktionspartner identifizieren und daraus ein hypothetisches „Interaktom“ von Zfp819 generieren. Die Einordnung der putativen Interaktionspartner nach ihrer Gen-Ontologie (GO) ließ vermuten, dass Zfp819 eine Rolle in der Regulation der Transkription, der Aufrechterhaltung der genetischen Integrität und im Zellzyklus bzw. bei der Apoptose spielt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die sehr intensive Expression von Zfp819 in undifferenzierten pluripotenten Zelllinien gezeigt. Desweiteren konnte die Promotorregion von Zfp819 identifiziert werden, und es wurde gezeigt, dass diese mit epigenetischen Mustern ausgestattet ist. Zusätzlich konnten wir Regionen im Zfp819-Gen identifizieren, die für die nukleäre Lokalisation von Zfp819 verantwortlich sind. Desweiteren konnten wir zeigen, dass Zfp819 in der transkriptionellen Repression von spezifischen endogenen, retroviralen Elementen (ERVs) in pluripotenten Zellen eine Rolle spielt. Durch zelluläre und biochemische Studien konnten wir zeigen, dass Zfp819 mit vielen Proteinen interagiert (z.B. Kap1 und Chd4), welche für die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität von Bedeutung sind. Tatsächlich resultierte der Verlust von Zfp819 in embryonalen Stammzellen in einer erhöhten Anfälligkeit für DNA-Schäden und in einer verminderten DNA-Reparatur. Zusammenfassend lassen die Identifizierung der Interaktionspartner sowie die Ergebnisse der molekularen und der funktionellen Studien vermuten, dass Zfp819 durch die Unterdrückung von ausgewählten ERVs eine Rolle in der Regulation der genomischen Stabilität von pluripotenten Zellen spielt.