Transport Mechanisms of the Vesicular Glutamate Transporter 1

Abstract

In der neuronalen Signaltransmission spielen die vesikulären Neurotransmittertransporter eine Schlüsselrolle in der Modifikation der Quantengröße. Sie sind verantwortlich für die Befüllung der synaptischen Vesikel (SVs) mit Neurotransmittern und werden vom elektrochemischen Gradienten (ΔµH+) angetrieben, welcher durch die vakuole ATPase (V-ATPase) generiert wird. Die Aufklärung der Regulationsmechanismen der SV-Beladung kann entscheidend zur Beantwortung fundamenteller Fragen zu synaptischen Funktionen beitragen. Insbesondere der Mechanismus des vesikulären Glutamattransporters (VGLUT), der die SVs mit L-Glutamat befüllt, konnte bisweilen nicht zufriedenstellend aufgeklärt werden. Beispielsweise ist bisweilen nicht klar welcher Mechanismus der biphasischen Abhängigkeit des Transporters von Chlorid-Ionen unterliegt. Desweiteren wurden widersprüchliche Daten zur Chlorid-Leitfähigkeit des Transporters veröffentlicht. Kürzlich wurde ein Regulationsmodus vorgeschlagen, der die Glutamataufnahme durch den Austausch eines luminalen Protons mit einem cytosolischen Kalium-Ion stimuliert. Der Fokus der vorliegenden Studie liegt hauptsächlich auf dem Chlorid-Transport durch VGLUT1 und der Regulierung von VGLUT1 durch den vermeintlichen Kalium-Ion/Proton Austausch mit dem Ziel den ionischen Mechnismus des Glutamattransportes aufzuklären. Die Fragen um den ionischen Kupplungsmechanismus wurden unter Verwendung eines minimalen Systems adressiert, das aus dem rekombinanten Maus-VGLUT1 und einer Protonenpumpe aus dem Bacillus thermophilus (TF0F1) rekonstituiert in künstliche Membranen besteht und in der vorliegenden Arbeit etabliert wurde. Die VGLUT1/TF0F1 Liposomen wiesen keine Chlorid-Leitfähigkeit auf -im Gegensatz zu früheren Studien. Zudem haben hohe luminale Chlorid-Konzentrationen keinen stimulierenden Effekt auf die Glutamataufnahme gezeigt, wie zuvor berichtet. Dieses Ergebnis bestätigt zusätzlich eine fehlende Chlorid-Leitfähigkeit durch VGLUT1. Bei Untersuchungen an SVs konnte der kürzlich beschriebene Kalium-Ion/Proton Austausch beobachtet werden. Bemerkenswerterweise haben erste Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass VGLUT1 selbst für den Kalium-Ion/Proton Austausch in SVs verantwortlich ist. Desweiteren wurde in dieser Arbeit ein neuartiges „Hybrid“-System entwickelt, bestehend aus SVs und Proteoliposomen mit TF0F1 und fusionsmediierenden Proteinen, die miteinander fusioniert werden. Die Einzigartigkeit dieser „fusionierten SVs“ liegt in der erstmals möglichen Modifikation des SV-Lumens, eine bisweilen schwer umsetzbare Herausfoderung. Die Glutamataufnahme kann in „fusionierten SVs“ ohne Aktivitätsverlust erhalten werden. Die „fusionierten SVs“ bieten u.a. eine einzigartige Möglichkeit den luminalen Effekt hoher Chlorid-Konzentrationen auf die Glutamataufnahme in SVs zu untersuchen.