The influence of autophagy on the fruiting-body development of the filamentous fungus Sordaria macrospora
by Oliver Voigt
Date of Examination:2012-10-17
Date of issue:2013-05-17
Advisor:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
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Format:PDF
Abstract
English
Autophagy, a tightly controlled degradation process in which a eukaryotic cell digests its own proteins and organelles during starvation or stress, has been shown to be involved in various developmental processes. The molecular dissection of autophagy has been mostly performed in the unicellular budding yeast Saccharomyces cerevisiae. However, its involvement in developmental processes of multicellular filamentous ascomycetes is largely unknown. Fungal fruiting-body development is a complex cellular differentiation process from a two dimensional mycelium to a three dimensional perithecium that requires specific environmental conditions and is controlled by many developmentally regulated genes. In this study the fungal model organism S. macrospora serves as host to investigate the impact of autophagy on the fruiting-body development. Sordaria macrospora is a coprophytic filamentous acscomycete which propagates solely sexually being ideal for the addressed question of this thesis. A set of autophagy related genes was chosen to be investigated. Homologous to members of the ascomycete family, the autophagic genes Smvps34, Smvps15, Smatg8, Smatg4 and Smjlb1 were isolated. Deletion of these genes was the first step to elucidate their function in autophagy and thus fruiting-body development. Deletion of the phospholipid kinase Smvps34 and the protein kinase Smvps15 resulted in lethality of the transformants as verified by a germination assay. Deletion of genes encoding for a structural component of the autophagosome, Smatg8, and Smatg4, a cysteine protease processing SmATG8 also impaired fruiting-body development and vegetative growth. Localization of SmATG8 to the autophagosomes and SmATG4 to the cytoplasm is consistent to reports in other ascomycetes. Processing of SmATG8 by SmATG4 was confirmed also by fluorescence microscopy and immuno blotting. In an S. cerevisiae Ape1 maturation assay SmATG8 and SmATG4 were capable to rescue the respective yeast deletion strains and indicated a high conservation of these genes among Ascomycota. Abolition of fruiting-body development was caused by the deletion of the bZIP transcription factor Smjlb1 as well as impairment of vegetative growth. SmJLB1 is localized to the nucleus and expression regulation of at least Smatg8 and Smatg4 was affirmed by qRT-PCR experiments indicating the involvement of SmJLB1 in autophagy. The data of this work suggest that autophagy and fruiting-body development in the filamentous ascomycete S. macrospora are tightly connected.
Keywords: filamentous ascomycete; autophagy; Sordaria macrospora; fruiting body
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Autophagie ist ein Degradationsprozess der streng reguliert ist und in welchem eine eukaryotische Zelle
zelleigene Organellen und Proteine bei Nährstoffmangel abbaut. Außerdem konnte gezeigt werden, dass
dieser Prozess auch in verschiedene Entwicklungsprozesse involviert ist. Die molekulare Entschlüsselung
der Autophagie wurde hauptsächlich in der Bäckerhefe S. cerevisiae vorgenommen. Allerdings ist
Beteiligung der Autophagie an Entwicklungsprozessen in multizellulären filamentösen Ascomyceten
weitestgehend unbekannt. Die Fruchtkörperentwicklung von Pilzen ist ein komplex gestalteter
Differenzierungsprozess der von einem zwei-dimensionalem Pilzgeflecht ausgeht das sich zu einem dreidimensionalem
Perithezium entwickelt. Die Fruchtkörperentwicklung erfordert spezifische
Umgebungsbedingungen und wird durch viele entwicklungsassoziierten Genen reguliert. In dieser Studie
diente der Modellorganismus Sordaria macrospora zur Untersuchung des Einflusses der Autophagie auf
die Fruchtkörperentwicklung. Der coprophytische filamentöse Ascomycet S. macrospora pflanzt sich
lediglich sexuell fort, was ihn ideal für die Fragestellung dieser Arbeit macht. Für diese Arbeit wurden eine
Reihe konservierter Autophagie bezogener Gene auserwählt. Folgende Gene die homolog zu denen anderer
Ascomyceten sind wurden isoliert: Smvps34, Smvps15, Smatg8, Smatg4, und Smjlb1. Durch die Deletion
dieser Gene sollte geklärt werden wie Autophagie in die Fruchtkörperentwicklung involviert ist. Die
Deletion des Phospolipidkinase Gens Smvps34 und des Proteinkinase Gens Smvps15 führte zur Lethalität
von S. macrospora was durch eine Auskeimungsuntersuchung belegt wurde. Die Deletion des Gens
Smatg8, welches eine autophagosomale Strukturkomponente kodiert und des Gens Smatg4, das eine
Cystein-Protease kodiert, die SmATG8 prozessiert, beeinträchtigte ebenfalls die Fruchtkörperentwicklung
und das vegetative Wachstum. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, daß SmATG8 in
Autophagosomen lokalisiert und SmATG4 vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist. Die Prozessierung
von SmATG8 durch SmATG4 wurde ebenfalls durch Fluoreszenzmikroskopie und Western-blot Analyse
bestätigt. Die heterologe Expression von Smatg8 und Smatg4 in S. cerevisiae und der Ape1
Reifungsuntersuchung zeigte, das die cDNA von Smatg8 und Smatg4 den Deletionsphenotyp der jeweiligen
Hefedeletionsmutanten aufheben konnte. Somit konnte die Konservierung dieser beiden Gene innerhalb der
Ascomyceten gezeigt werden. Die Blockade der Fruchtköperentwicklung wurde durch die Deletion des
bZIP Transkriptionsfaktor Gens Smjlb1 verursacht genauso wie die Beeinträchtigung des vegetativen
Wachstums. SmJLB1 ist im Kern lokalisiert und durch qRT-PCR Experimente wurde gezeigt, dass die
Autophagiegene Smatg8 und Smatg4 durch Smjlb1 reguliert werden. Dies läßt vermuten, dass Smjlb1 in den
Prozess der Autophagie involviert ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass Autophagie und
Fruchtkörperentwicklung des filamentösen Pilzes S. macrospora streng miteinander verknüpft sind.