Neue Biomarker zur Überwachung der zellulären Immunität chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen

Abstract

Zurzeit existieren keine validen Biomarker, welche die Krankheitsaktivität oder das Rezidiv-Risiko von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen objektivierbar machen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Biomarker des Immunmonitorings auf ihren Nutzen bei der Beurteilung der Krankheitsaktivität von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) untersucht. Hierzu wurde bei 98 Patienten mit CED, nach positivem Votum der Ethikkommission, die intrazelluläre ATP-Konzentration der CD4+-Zellen gemessen, um diese mit der Krankheitsaktivität der Patienten in Bezug zu setzen. Die Patientendaten wurden zuvor mithilfe von standardisierten Fragebögen erhoben, um daraufhin die Krankheitsaktivitätsindices CDAI, HBI und SCCAI aus den klinischen Daten zu ermitteln. Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen der ATP-Konzentrationen und der Krankheitsaktivität der Patienten festgestellt. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass Einzelmessungen der intrazellulären ATP-Konzentration von Lymphozyten nicht die Krankheitsaktivität von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen widerspiegeln. Ein signifikanter Unterschied der intrazellulären ATP-Konzentration CD4+-Zellen wurde allerdings zwischen Patienten mit und ohne Infliximab-Therapie nachgewiesen. Die Patienten, die unter einer Infliximab-Therapie standen, hatten signifikant niedrigere intrazelluläre ATP-Konzentrationen der Lymphozyten (p<0,01, Mann-Whitney-U). Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass Infliximab als TNF-α-Blocker die Immunantwort bzw. die Aktivität von Lymphozyten inhibiert. Mithilfe der intrazellulären ATP-Konzentration wäre somit evtl. ein Werkzeug gegeben, um die Effektivität der Inhibierung der lymphozytären Immunreaktion durch TNF-α-Blocker zu kontrollieren. Weiterhin wurde bei 99 CED-Patienten die Anzahl regulatorischer T-Zellen im peripheren Blut bestimmt. Hierfür wurden die Zellen mithilfe von CD4-, CD25-, CD127- und FoxP3-Antikörpern angefärbt und mittels der FACS-Analytik quantifiziert. Anschließend wurde die so ermittelte Anzahl regulatorischer T-Zellen (CD4+CD25highCD127-FoxP3+-Zellen) mit der Krankheitsaktivität der Patienten korreliert. Auch dabei wurde keine signifikante Korrelation nachgewiesen. Bei der Unterteilung der Patienten in Gruppen mit erhöhter und erniedrigter Krankheitsaktivität deutete sich ein Unterschied bezüglich der Anzahl regulatorischer T-Zellen an, der jedoch nicht signifikant war (p=0,073, Mann-Whitney-U-Test). Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, dass sich die durchflusszytometrisch quantifizierte Anzahl regulatorischer T-Zellen ebenfalls nicht als Surrogatmarker für die Krankheitsaktivität von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen eignet. Zudem wurde postuliert, dass die Quantifizierung von Tregs keine Hilfe bei der Unterscheidung zwischen den beiden Erkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa liefern kann. Der tendenzielle Unterschied in der Anzahl von Tregs zwischen Patienten mit niedriger und erhöhter Krankheitsaktivität zeigt jedoch, dass regulatorische T-Zellen bei der Pathogenese von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen eine Rolle zu spielen scheinen. Allerdings deutet sich auch eine Abhängigkeit von weiteren pathogenen Faktoren in der komplexen Ätiologie von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen an. Bei 35 der CED-Patienten wurde zusätzlich eine weitere Methode zur Quantifizierung regulatorischer T-Zellen angewendet. Hierbei handelte es sich um einen DNA-Methylierungsassay, welcher die regulatorischen T-Zellen anhand einer spezifischen Demethylierungsregion der DNA (TSDR) ermittelt. Diese TSDR ist bei den Tregs demethyliert, während sie bei allen anderen Zellen des Blutes methyliert ist. Die Ergebnisse dieses Assays korrelierten jedoch nicht mit der Krankheitsaktivität der Patienten und korrelierten auch nicht mit den Ergebnissen für die Anzahl regulatorischer T-Zellen aus der FACS-Analytik. Diese Tatsache könnte zum einen darauf beruhen, dass in der FACS-Analytik im Gegensatz zum DNA-Methylierungsassay auch aktivierte T-Effektorzellen quantifiziert werden, welche nur transient FoxP3 exprimieren. Zum anderen werden mittels des DNA-Methylierungsassays auch CD8+FoxP3+-Zellen quantifiziert, welche keine oder geringe regulatorischen Eigenschaften besitzen und in der Durchflusszytometrie nicht quantifiziert werden. Zudem könnte eine fehlende Korrelation zwischen den Ergebnissen der beiden Verfahren auch daran liegen, dass sich die quantifizierten Tregs aus der Durchflusszytometrie auf die Gesamtheit der CD4+-Zellen beziehen, während sich die Tregs des DNA-Methylierungsassays auf die gesamten DNA-haltigen Zellen des Vollblutes beziehen. Zur besseren Vergleichbarkeit könnte in zukünftigen Studien ein Quotient aus Tregs und CD4+-Zellen gebildet werden. Zusammenfassend hat sich im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass sich weder mithilfe der intrazellulären ATP-Konzentrationen von Lymphozyten noch der Anzahl regulatorischer T-Zellen eine Aussage bezüglich der Krankheitsaktivität oder des Rezidivrisikos von CED-Patienten treffen lässt. Da die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen derzeit nicht heilbar sind, werden weitere Surrogatmarker zum Objektivieren der Krankheitsaktivität benötigt, um Krankheitsrezidiven zeitnah entgegenwirken zu können.