Charakterisierung von Punktmutationen in der DNA-Bindedomäne des humanen Transkriptionsfaktors STAT1
Characterization of point mutation in the DNA-binding domain of the human transcription factor STAT1
by Jana Johanne Naegeler
Date of Examination:2015-03-09
Date of issue:2015-02-23
Advisor:Prof. Dr. Thomas Meyer
Referee:Prof. Dr. Dieter Kube
Referee:Prof. Dr. Rainer Mausberg
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-4908
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Abstract
English
Signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) is a member of the conserved protein family of cytokine-regulated transcription factors and plays a decisive role in many biological processes such as the control of the immune response and cell proliferation. Upon stimulation of the cells with interferon-gamma (IFN-gamma), receptor-associated JAK kinases phosphorylate a signature tyrosine residue in the carboxy-terminus of STAT1. Tyrosine-phosphorylated STAT1 homodimers then accumulate in the nucleus, where they recoginze specific binding sites in the promoters of STAT1-dependent target genes. In the present study, it was investigated whether three surface-exposed and conserved amino acid residues in the DNA-binding domain (Lys 359, Lys 361, and Asp 367) are involved in the transduction of IFN-gamma-mediated signal intensity. For this purpose, I performed a mutagenesis approach and substituted the three amino acid residues to alanines. However, none of the three resulting point mutants exhibited altered kinetics of tyrosine phosphorylation, inducible nuclear accumulation or dissociation from high-affinity binding sites on DNA as compared to the wild-type molecule. Similarly, the transcriptional activation of a reporter gene construct and expression of numerous investigated IFN-gamma-dependent endogenous target genes were unaffected by the mutations. In summary, I found no detectable differences in the behavior of the mutants when compared to the wild-type molecule. However, the possibility cannot be excluded that unrecognized changes in non-canonical STAT1 functions accounted for the conserved homology of these residues.
Keywords: STAT1; binding domain
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Der Signaltransduktor und Aktivator der Transkription 1 (STAT1) ist ein Mitglied der konservierten Proteinfamilie von zytokinregulierten Transkriptionsfaktoren und spielt bei vielen biologischen Prozessen, wie beispielsweise der Steuerung der Immunantwort und der Zellproliferation, eine entscheidende Rolle. Bei Stimulation der Zellen mit Interferon-gamma (IFN-gamma) phosphorylieren rezeptorassoziierte JAK-Kinasen einen kritischen Tyrosinrest im Carboxyterminus von STAT1. Die Tyrosin-phosphorylierten STAT1-Homodimere akkumulieren daraufhin im Zellkern, wo sie spezifische Bindestellen in den Promotoren von STAT1-abhängigen Zielgenen erkennen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob drei oberflächenexponierte und konservierte Aminosäurereste in der DNA-Bindedomäne (Lys 359, Lys 361 und Asp 367) an der Weiterleitung der Signalintensität beteiligt sind. Zu diesem Zweck führte ich einen Mutageneseansatz durch und substituierte die drei Aminosäurerreste zu Alaninen, doch keiner der drei erhaltenen Punktmutanten zeigte eine gegenüber dem Wildtyp-Molekül geänderte Kinetik der Tyrosin-Phosphorylierung, der induzierbaren Kernakkumulation sowie der Dissoziation von hochaffinen DNA-Bindestellen. Auch blieben die transkriptionelle Aktivierung eines Reportergenkonstrukts und die Expression von sämtlichen der untersuchten IFN-gamma-abhängigen endogenen Zielgene durch die Mutationen unverändert. Zusammendfassend fand ich keine Unterschiede im detektier-baren Verhalten der Mutanten gegenüber dem Wildtyp-Molekül. Doch kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich Änderungen in den hier nicht erfassten nicht-kanonischen STAT1-Funktionen ergeben könnten, die kausal für die Homologie dieser Reste verantwortlich sind.
Schlagwörter: STAT1; Bindedomäne