Zelltyp-spezifische Interaktionen von Toxoplasma gondii und murinen Skelettmuskelzellen in vitro
Cell-type specific interactions between Toxoplasma gondii and murine Skeletal Muscle Cells in vitro
by Izabela Swierzy
Date of Examination:2014-01-16
Date of issue:2014-06-26
Advisor:Prof. Dr. Carsten Lüder
Referee:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Referee:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:PD Dr. Stefan Irniger
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
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Name:Dissertation Izabela Swierzy- SUB Göttingen.pdf
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Format:PDF
Abstract
English
Toxoplasma gondii is one of the most common intracellular protozoan parasites worldwide and an important human pathogen. Its life cycle includes three stages: sporozoites, tachyzoites and bradyzoites. While sporozoites are formed during sexual reproduction in the definitive host (Feloidea) and released into the environment, tachyzoites and bradyzoites reproduce asexually by endodyogeny in intermediate hosts such as birds and mammals including humans and lifestock animals. Tachyzoites represent an actively replicating stage infecting virtually any nucleated cell type. During infection, they differentiate to dormant bradyzoites, which form tissue cysts and which persist preferentially in neuronal or muscle (especially skeletal muscle, SkM) tissues of intermediate hosts. Reactivation of dormant bradyzoites in immunocompromized patients or primary infection of pregnant women and subsequent transmission to the fetus can lead to life-threatening reactivated and congenital toxoplasmosis, respectively. The ingestion of raw or undercooked meat from chronically infected animals containing tissue cysts represents one of the main infection routes of T. gondii. Therefore, skeletal muscle cells (SkMCs) are considered crucial for the food-borne transmission of toxoplasmosis to humans. The aim of this study was therefore the identification and characterisation of cell type-specific factors, which might regulate the Toxoplasma development and bradyzoite formation within SkMC. The cell type-specific interactions were investigated using permanent mouse-derived SkMCs (C2C12 myoblasts) in vitro. Importantly, C2C12 myoblasts differentiate terminally to polynucleated, contractile myotubes in horse serum-containing culture medium or due to cultivation at increased cell density. Immunoblotting and quantitative RT-PCR validated the differentiation of C2C12 cells to myotubes by detection of the myogenic transcription factors MyoD, myogenin and the muscle differentiation marker Myosin Heavy Chain (MyHC). In addition, withdrawal from the cell cycle leading to a post-mitotic state of C2C12 myotubes was confirmed by the absence of BrdU labeling of myotubes but not myoblasts. Infection of terminally differentiated C2C12 myotubes, proliferating C2C12 myoblasts and NIH3T3 control fibroblasts with T. gondii revealed higher expression of the bradyzoite specific genes BAG1 and ENO1 and increased cyst formation in differentiated myotubes as compared to myoblasts and fibroblasts. Additionally, parasite replication was clearly lower in myotubes than in C2C12 myoblasts or NIH3T3 fibroblasts. These data for the first time highlight the importance of the cell type and the state of terminal differentiation of SkMC myotubes for the T. gondii development and for the formation of potentially persisting bradyzoites. In order to identify cell type-specific interactions of T. gondii with its host cell, we used high-throughput RNA sequencing to analyse the parasite and host cell transcriptomes before and after 24 hours of infection of terminally differentiated SkMCs and neurons as well as actively proliferating fibroblasts and astrocytes. The analyses showed a significantly higher impact of the host cell type-specific gene expression on the transcriptome of the four cell types than the changes in gene expression due to a Toxoplasma infection. However, the results also identified some distinctive gene clusters that were similarly expressed in terminally differentiated neurons and SkMCs but differently expressed in fibroblasts and astrocytes. Remarkably, after infection of SkMCs and neurons but not astrocytes or fibroblasts with T. gondii, the parasite-triggered host cell transcriptomes were particularly enriched for genes encoding cell cycle regulators, indicating their potential involvement in the Toxoplasma stage conversion. Therefore, the expression profiles of selected host cell cycle regulators were determined by RT-qPCR and immunoblotting in the course of C2C12 SkMC terminal differentiation and Toxoplasma infection. The expression of both the negative cell cycle regulators Tspyl2 and its downstream target gene p21 increased during myogenic differentiation. This was accompanied by a decrease in expression of the cell cycle activators CyclinB1 and Uhrf1. After parasite infection, Tspyl2 but not p21 expression further increased in infected myotubes as compared to myoblasts and fibroblasts. Remarkably, CyclinB1 and Uhrf1 also increased specifically in differentiated SkMCs, but not myoblasts or fibroblasts after infection suggesting partial activation of the SkMCs cell cycle. However, BrdU labeling clearly demonstrated that the cell cycle arrest of terminally differentiated myotubes was nevertheless not abrogated by T. gondii infection. Since overexpression of the negative cell cycle regulator CDA1 (the human Tspyl2 ortholog) favours bradyzoite formation in human fibroblasts, we investigated the functional importance of Tspyl2 for SkMC differentiation and Toxoplasma development in SkMCs by RNA interference. Knock-down of Tspyl2 inhibited C2C12 myoblast differentiation towards polynucleated myotubes. Interestingly, this was accompanied by increased parasite replication and repression of bradyzoite formation as well as tissue cyst formation after infection of two selected Tspyl2 shRNA-C2C12 tranfectants as compared to wild type myotubes and control transfectants. Together, these data indicate a crucial impact of expression of Tspyl2 and the state of terminal differentiation of SkMCs for triggering stage conversion of T. gondii. Differentiation of SkMC to polynucleated myotubes caused altered expression profiles of cytokines and chemokines in C2C12 myotubes as compared to myoblasts and control fibroblasts. Furthermore, several pro-inflammatory cytokines (IL-23, IL-1α and IL-1β) and the chemokine CCL2 were expressed at significantly higher levels in myotubes than in myoblasts or fibroblasts after infection. Together, this indicated the potential importance of pro-inflammatory immune factors, besides cell cycle regulators, in the cell type-specific Toxoplasma stage conversion in differentiated SkMC. In this study, it was shown for the first time that the negative cell cycle regulator Tspyl2 and the differentiation state of syncytial SkMC myotubes clearly influences Toxoplasma stage conversion and cysts formation. Since myogenic terminal differentiation is initiated by cell cycle regulators (like Tspyl2) and their expressions are obviously influenced by T. gondii infection, parasite-induced up-regulation of cell cycle regulators as shown herein might facilitate spontaneous stage differentiation of fast-replicating tachyzoites to persisting bradyzoites in SkMCs. Furthermore, myotubes respond to Toxoplasma infection with the increased expression of proinflammatory molecules, thereby presumably contributing to the local immune response to the parasite.
Keywords: Toxoplasma gondii; Skeletal Muscle Cell; T. gondii-host cell interaction; Cell cycle; Testis-specific Y-encoded-like protein 2; Tspyl2; Persistence
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Toxoplasma gondii ist einer der häufigsten intrazellulären Protozoen weltweit und ein wichtiger Krankheitserreger des Menschen. Er kommt in drei Lebensstadien vor: Sporozoiten, Tachyzoiten und Bradyzoiten. Während Sporozoiten nach sexueller Vermehrung im Endwirt (Katzenartige) und Freisetzung in die Umwelt gebildet werden, entstehen Tachyzoiten und Bradyzoiten asexuell durch Endodyogenie in Zwischenwirten wie Vögeln, Säugetieren und dem Menschen. Tachyzoiten sind schnell replizierende Parasiten, die nahezu jede nukleäre Zelle des Körpers infizieren können. Dagegen bilden die nach Differenzierung von Tachyzoiten entstehenden, weitgehend ruhenden Bradyzoiten Gewebszysten und persistieren bevorzugt in neuronalen oder muskulären Geweben der Zwischenwirte. Der Verzehr von Bradyzoiten-haltigem, rohem oder ungegartem Fleisch von T. gondii-infizierten Nutztieren ist einer der Hauptübertragungswege des Parasiten auf den Menschen und kann zum Ausbruch der Toxoplasmose-Krankheit führen. Die Toxoplasmose ist vor allem bei immunsupprimierten Patienten und erstmalig infizierten Schwangeren nach Übertragung auf den Fötus klinisch gefährlich und kann sogar tödlich enden. Da Fleischverzehr infizierter Nutztiere einen der Hauptinfektionswege darstellt, weisen Skelettmuskelzellen (SkMZ) eine enorme Bedeutung für die Übertragung von Toxoplasma auf den Menschen auf.
Das Ziel dieser Arbeit war es daher, zelltyp-spezifische Faktoren zu identifizieren und zu charakterisieren, die die Toxoplasma-Entwicklung und Bradyzoitenbildung in SkMZ regulieren.
Die Untersuchungen wurden mithilfe der murinen C2C12-SkMZ-Linie in vitro durchgeführt, die von proliferierenden Myoblasten in Pferdeserum-haltigem Medium oder aufgrund erhöhter Zelldichte effektiv zu polykernigen Myotuben differenzierten. Die Effektivität der terminalen Differenzierung von C2C12-SkMZ wurde durch den Nachweis muskelspezifischer Marker wie MyoD, Myogenin und Myosin Heavy Chain (MyHC) mittels Reverse Transkriptase-qPCR (RT qPCR), Immunfluoreszenz sowie Nachweis des Zellzyklusarrests mittels BrdU-Markierung validiert.
Die Infektion von terminal differenzierten C2C12-Myotuben, proliferierenden C2C12-Myoblasten und murinen NIH3T3-Kontrollfibroblasten mit T. gondii zeigte, dass der Parasit in Myotuben deutlich mehr bradyzoitenspezifische ENO1- bzw. BAG1-Transkripte exprimierte als in Myoblasten und Fibroblasten. Außerdem war die Gewebszystenbildung bei gleichzeitig reduzierter Parasitenreplikation in terminal differenzierten C2C12-Myotuben deutlich erhöht. Demgegenüber förderten proliferierende C2C12-Myoblasten und NIH3T3-Fibroblasten die Replikation von Toxoplasma bei gleichzeitig geringer Bradyzoitenbildung. Diese Daten weisen erstmalig auf die Bedeutung des Zelltyps und dessen Differenzierung für die Parasitenentwicklung und die Stadienkonversion in SkMZ hin.
Für genauere Untersuchungen von Zelltyp-spezifischen Interaktionen mit T. gondii wurden die Transkriptome von terminal differenzierten C2C12-Myotuben und Neuronen sowie von proliferierenden NIH3T3-Fibroblasten und Astrozyten vor und nach Infektion mit T. gondii für 24 Stunden mittels High-Throughput RNA-Sequenzierung ermittelt. Die Analysen zeigten einen deutlich größeren Einfluss der zelltyp-spezifische Genexpression auf das Gesamttranskiptom der vier Zelltypen als die Expressionsveränderungen aufgrund der Toxoplasma-Infektion. Allerdings wurden auch Gengruppen identifiziert, die in den terminal differenzierten SkMZ und Neuronen im Vergleich zu Fibroblasten und Astrozyten differentiell exprimiert waren. Des Weiteren bewirkte die T. gondii-Infektion eine signifikante Expressionssteigerung u. a. von Zellzyklus-regulierenden Transkripten spezifisch in terminal differenzierten SkMZ und Neuronen, was auf ihre mögliche Beteiligung an der Toxoplasma-Stadienkonversion hindeutete. Daher wurden anschließend die Expressionsprofile ausgesuchter Zellzyklusregulatoren im Laufe der terminalen C2C12-SkMZ-Differenzierung und der Toxoplasma-Infektion mittels RT qPCR- und Western Blot-Analysen untersucht. Während die Transkription der negativen Zellzyklus-Modulatoren Tspyl2 und dem ‚down stream‘-liegenden Targetgen p21 im Laufe der terminalen Differenzierung von C2C12-Myoblasten zunahm, sank begleitend die Transkription der Uhrf1- und Ccnb1- (CyclinB1) Aktivatoren. Nach Infektion wurde spezifisch in Myotuben, nicht aber in Myoblasten oder Fibroblasten, eine weitere Steigerung der Tspyl2-Transkripte durch RT-qPCR-Analysen nachgewiesen. Gleichzeitig reagierten C2C12-Myotuben auch mit Hochregulation der Uhrf1- und Ccnb1-Transkription auf Toxoplasma-Infektion. Allerdings wurde durch BrdU-Markierung nachgewiesen, dass die spezifische Modulation von Zellzyklusregulatoren nach Infektion von Myotuben den Zellzyklusarrest nicht aufhob und C2C12-Myotuben nicht zur Zellteilung anregte.
Da Überexpression von CDA-1 (humanes Tspyl2-Ortholog) in humanen Fibroblasten die Stadienkonversion von T. gondii fördert, wurde die Funktion des Tspyl2-Zellzyklusregulators in SkMZ analysiert. ‚Knock-down‘ von Tspyl2 mittels shRNA unterdrückte effektiv die terminale C2C12-Myoblastendifferenzierung. Bemerkenswerterweise führte dies nach T. gondii-Infektion zweier ausgesuchter Tspyl2 shRNA-C2C12-Transfektanten zu einer verstärkten Toxoplasma-Replikation im Vergleich zu Kontrolltransfektanten und WT Myotuben. Gleichzeitig war in Tspyl2-‚Knock-down‘-Mutanten die Parasitendifferenzierung zum Bradyzoitenstadium sowie die Gewebezystenbildung vermindert. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, dass in SkMZ die spontane Differenzierung von T. gondii zum Bradyzoiten wesentlich von dem Zellzyklusregulator Tspyl2 und der terminalen Myotubendifferenzierung abhängt.
Differenzierung von SkMZ führte u.a. auch zu veränderten Expressionsprofilen von Zytokinen und Chemokinen in C2C12-Myotuben, -Myoblasten und Kontrollfibroblasten. So wurden mehrere pro-inflammatorischen Zytokine in Myotuben deutlich stärker als in Myoblasten oder Fibroblasten exprimiert. Nach Infektion von C2C12-Myotuben stiegen die Transkriptmengen von IL-23, IL 1α und IL 1β an. Diese Ergebnisse könnten neben Zellzyklusregulatoren auch auf den Einfluss von Immunfaktoren bei der Zelltyp-spezifischen Stadienkonversion in differenzierten SkMZ hindeuten
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass der Differenzierungsstatus der SkMZ die Stadienkonversion und die Gewebszystenbildung eindeutig beeinflusst. Da die terminale SkMZ-Differenzierung von Zellzyklusregulatoren eingeleitet wird und ihre Expressionen offensichtlich unter dem Einfluss der T. gondii-Infektion stehen, könnten sie einen Einflus auf die Induktion der Stadiendifferenzierung von schnell replizierenden Tachyzoiten zu persistierenden Bradyzoiten ausüben, was am Beispiel des negativen Zellzyklusregulators Tspyl2 in dieser Arbeit nachgewiesen wurde. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Myotuben mit der Produktion von proinflammatorischen Molekülen aktiv auf die Toxoplasma-Infektion reagieren und ihre Expression zur lokalen Immunantwort der SkMZ beitragen dürften.
Schlagwörter: Toxoplasma gondii; Skelettmuskelzellen; T.gondii-Wirtszell-Interaktionen; Zellzyklus; Persistenz; Tspyl2; Testis-specific Y-encoded-like protein 2