Bedeutung der ACE2-Spaltung durch Wirtszellproteasen für die SARS-Coronavirus-Infektion
Importance of ACE2 cleavage by host cell proteases for the SARS-coronavirus-infection
by Adeline Heurich
Date of Examination:2014-07-14
Date of issue:2014-07-29
Advisor:Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Referee:Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-4629
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Abstract
English
The Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) is a highly pathogenic virus and its zoonotic entry into the human population represents a substantial health threat. The identification of host cell factors important for SARS-CoV spread and pathogenesis might yield new targets for therapy. The SARS-CoV envelope protein spike (S) binds to the cellular receptor, Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2), and mediates viral entry into target cells. Cleavage and activation of the S protein by host cell proteases is essential for the infectious S protein-mediated entry. The type II transmembrane serine proteases (TTSPs) TMPRSS2 and HAT cleave and activate the S protein, at least upon expression in cell culture. Whether these enzymes are expressed in human lung cells, the target cells of SARS-CoV infection, was unclear and was to be investigated in the present thesis. TMPRSS2 and HAT also cleave the viral receptor ACE2 and it was postulated that ACE2 cleavage increases viral entry into host cells. However, the underlying mechanism was not known and was to be analyzed within the present study. It could be shown that TMPRSS2, HAT and ACE2 are coexpressed in epithelial cells of the respiratory tract. Therefore, these proteases could promote the spread of SARS-CoV in lung epithelium. Furthermore, an amino acid sequence in ACE2, which is essential for the processing by TMPRSS2 and HAT, was identified. The functional analysis of ACE2 mutants demonstrated that cleavage at this site increases S protein-driven host cell entry, and immunofluorescence studies provided evidence that the augmented entry efficiency was due to increased viral particle uptake into the cell. Finally, it was demonstrated that TMPRSS2 and another cellular protease, A Disintegrin And Metalloproteinase 17 (ADAM17), compete for ACE2 cleavage and the cleavage site for ADAM17 in ACE2 could be identified. However, ACE2 cleavage by ADAM17 was found to be dispensable for the S protein-driven cell entry. In summary, these studies indicate that TMPRSS2 and HAT promote SARS-CoV infection by cleavage of the viral S protein and its receptor. The proteases therefore constitute potential targets for antiviral intervention.
Keywords: respiratory viruses; ARDS; influenza; SARS-CoV; ACE2; TTSPs
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Das severe acute respiratory syndrome Coronavirus (SARS-CoV) ist ein hochpathogenes Virus, dessen zoonotischer Eintrag in die Bevölkerung eine substantielle Gesundheitsgefahr darstellt. Die Identifizierung von Wirtszellfaktoren, die für die SARS-CoV-Ausbreitung und Pathogenese wichtig sind, könnte neue Ansatzpunkte für die Therapie liefern. Das SARS-CoV-Oberflächenprotein Spike (S)
bindet an den zellulären Rezeptor angiotensin converting Enzyme 2 (ACE2) und vermittelt den viralen Eintritt in Zielzellen. Die Spaltung und Aktivierung des S Proteins durch Wirtszellproteasen ist für den infektiösen, S Protein-vermittelten Zelleintritt von SARS-CoV essentiell. Die Typ II Transmembranserinproteasen (TTSPs) TMPRSS2 und HAT spalten und aktivieren das S Protein, zumindest nach gerichteter Expression in Zelllinien. Ob diese Enzyme in der menschlichen Lunge, den Zielzellen der SARS-CoV-Infektion, exprimiert werden, war jedoch unklar und sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht werden. TMPRSS2 und HAT spalten auch den viralen Rezeptor ACE2 und es wurde postuliert, dass die ACE2-Spaltung den viralen Eintritt erhöht. Der zugrundeliegende Mechanismus war jedoch nicht bekannt und sollte innerhalb der vorliegenden Arbeit aufgeklärt werden.
Es konnte gezeigt werden, dass TMPRSS2 und HAT zusammen mit ACE2 in Epithelzellen des Respirationstrakts exprimiert werden. Die Proteasen könnten daher die Ausbreitung von SARS-CoV im Lungenepithel fördern. Weiterhin wurde eine Aminosäuresequenz in ACE2 identifiziert, die für die Prozessierung durch TMPRSS2 und HAT essentiell ist. Die funktionelle Analyse von ACE2- Mutanten zeigte, dass die Spaltung in diesem Bereich infektionsverstärkend wirkt.
Immunfluoreszenz-Studien erbrachten Hinweise darauf, dass die Verstärkung der Infektion auf eine erhöhte Aufnahme von Virus-Partikeln in die Zelle zurückzuführen ist. Schließlich konnte demonstriert werden, dass TMPRSS2 und eine weitere zelluläre Protease, A Disintegrin And Metalloproteinase 17 (ADAM17), um die ACE2-Spaltung konkurrieren und die ADAM17- Spaltstelle in ACE2 konnte kartiert werden. Die ACE2-Spaltung durch ADAM17 war jedoch für den S Protein-getriebenen Zelleintritt verzichtbar. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass TMPRSS2 und HAT die SARS-CoV-Infektion durch Spaltung von S Protein und Rezeptor fördern. Die Proteasen stellen daher mögliche Angriffspunkte für die antivirale Intervention dar.
Schlagwörter: respiratorische Viren; ARDS; Influenza; SARS- CoV; ACE2; TTSPs