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Paramagnetic Tagging of Oligonucleotides for Structure Determination using NMR-Spectroscopy

von Sebastian Täubert
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2015-01-16
Erschienen:2015-03-31
Betreuer:Prof. Dr. Christian Griesinger
Gutachter:Prof. Dr. Christian Griesinger
Gutachter:Prof. Dr. Ulf Diederichsen
crossref-logoZum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-5002

 

 

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Name:STaeubertDiss.pdf
Size:4.83Mb
Format:PDF
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Zusammenfassung

Englisch

Structure determination is one of the most fundamental fields of research, as it provides insights in biological systems and their mechanisms. Therein, NMR spectroscopy is an essential tool for investigations under physiological conditions and the development of new techniques, which enable the detection of more detailed information, is an ongoing topic of research. By using paramagnetic tagging of biomolecules, highly valuable NMR parameters, e.g. residual dipolar couplings (RDCs) and pseudocontact shifts (PCSs), can be determined, which provide angle and distance information about the target molecule. Therefore, several lanthanide-binding tags have been developed and successfully attached to proteins and oligosaccharides. Due to the paramagnetic properties of the lanthanide ions, an alignment of the target molecule is induced, which facilitates the determination of RDCs. Additionally, the NMR signals are shifted due to a dipole-dipole interaction between the nuclei and the lanthanide ion (PCS). Both of these effects can not be detected in conventional NMR spectroscopy, due to the isotropic distribution of orientations of a molecule in solution. A successful transfer of the protein tagging method to oligonucleotides has of yet not been reported, although DNA and RNA are two of the most important groups of biomolecules. Based on the recently developed Cys-Ph-TAHA tag, a reliable protocol for the determination of paramagnetic effects in a DNA molecule is presented in this work. To achieve this, a modified nucleobase was synthesized, which provides a suitable binding site for the Cys-Ph-TAHA tag. A tagging and purification protocol was established, by which two paramagnetic samples (thulium and terbium) and a diamagnetic reference sample (lutetium) were prepared. High resolution NMR spectroscopy revealed paramagnetically-induced PCSs and RDCs in the tagged oligonucleotide. The data evaluation proved a high quality of the determined PCSs for both samples. As 13C/15N labeling of synthesized DNA strands is unreasonable, due to the expensive starting materials and the low overall yield of the DNA synthesizer, all NMR spectra were performed using samples with natural abundance. Consequently, the signal-to-noise ratio of the NMR signals was relatively low and together with the paramagnetic relaxation enhancement, the determined RDCs have a significant error. Nevertheless, a suitable ensemble model was created, by which the combined PCS and RDC data was satisfactorily described. In conclusion, the technique of paramagnetic tagging was successfully transferred to an oligonucleotide. To do this, a reliable strategy for the incorporation of a binding site and sufficient tagging and purification protocols were established. This approach was verified by the determination and evaluation of PCSs and RDCs in a DNA strand.
Keywords: NMR Spectroscopy; Paramagnetic Tagging; Oligonucleotides; Residual Dipolar Coupling; Pseudocontact Shift

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Strukturaufklärung gehört zu den wichtigsten Gebieten der Grundlagenforschung, da sie direkte Einblicke in biologische Systeme und ihre Mechanismen liefert. Der NMR Spektroskopie kommt dabei eine besondere Bedeutung zu, denn sie ermöglicht Forschung unter physiologischen Bedingungen. Dementsprechend ist die Entwicklung neuer Techniken zur Verbesserung dieser Methode weiterhin ein zentrales Forschungsgebiet. Paramagnetische Markierung von Biomolekülen ermöglicht die Bestimmung von NMR Parametern, wie z.B. residuale dipolare Restkopplungen (RDCs) oder Pseudokontaktverschiebungen (PCSs), die für die Strukturaufklärung wertvolle Winkel- und Abstandsinformationen über das Zielmolekül beinhalten. In diesem Zusammenhang wurden Lanthanoidionen-koordinierende Tags entwickelt und erfolgreich an Proteinen angebracht. Durch die paramagnetischen Eigenschaften der Lanthanoidionen wird eine partielle Ausrichtung des Zielmoleküls im Magnetfeld des NMR Spektrometers induziert und somit das Messen residualer dipolarer Kopplungen ermöglicht. Zusätzlich werden die NMR Signale durch eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen dem Lanthanoidion und den Kernen verschoben (PCS). In der konventionellen NMR Spektroskopie werden diese Effekte, aufgrund der Brownschen Molekularbewegung und dem Fehlen eines Metallions, nicht beobachtet. In der Fachliteratur ist ein Transfer dieser Methode auf Oligonukleotide nicht bekannt, obwohl DNA und RNA zu den wichtigsten Biomolekülen überhaupt zählen. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des kürzlich entwickelten Cys-Ph-TAHA Tags ein Protokoll zur Bestimmung von paramagnetischen Effekten in der DNA entwickelt. Dafür wurde eine modifizierte Nukleobase synthetisiert, die eine passende Bindungsstelle für den Tag aufweist. Mit der neu entwickelten Methode wurden zwei paramagnetische und eine diamagnetische Referenzprobe hergestellt. Mittels hochauflösender NMR Spektroskopie konnten paramagnetisch-induzierte PCSs und RDCs gemessen werden. Die Auswertung zeigte eine hohe Qualität der gemessenen PCSs in beiden paramagnetischen Proben. Die RDCs wiesen einen signifikanten Fehler auf. Die in der NMR Spektroskopie übliche Isotopenmarkierung (13C/15N) ist bei im DNA-Synthesizer hergestellten Oligonukleotiden auf Grund der teuren Ausgangsmaterialien nicht möglich, sodass die hergestellten NMR Proben eine natürliche Isotopenhäufigkeit aufwiesen. In den NMR Spektren zur Bestimmung der RDCs ist damit das Verhältnis von Signal-zu-Rausch relativ niedrig, was zusammen mit der paramagnetischen Relaxationsverstärkung zu einem größeren Messfehler führt. Dennoch konnten die erhaltenen paramagnetischen Daten mit einem Ensemblemodell beschrieben werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der paramagnetischen Markierung erfolgreich auf die Stoffklasse der Oligonukleotide übertragen. Dabei wurde ein reproduzierbares Protokoll entwickelt, mit dem eine Bindungsstelle in einen DNA Strang eingebaut und das Zielmolekül anschließend mit dem Cys-Ph-TAHA Tag markiert wurde. Die erfolgreiche Anwendung der Methode konnte durch die erhaltenen paramagnetischen Messwerte von hoher Qualität verifiziert werden.
 

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