Influence of Grassland Management and Herbivory on Diversity and Ecology of plant-associated Bacterial Communities
by Franziska Wemheuer
Date of Examination:2013-07-04
Date of issue:2015-05-29
Advisor:Prof. Dr. Stefan Vidal
Referee:Prof. Dr. Stefan Vidal
Referee:Prof. Dr. Rolf Daniel
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Name:PhD_thesis_Franziska_Wemheuer_ediss.pdf
Size:5.71Mb
Format:PDF
Abstract
English
In the last years, plant-associated bacterial communities caught the attention of investigators due to their importance for both plant health and the environmental balance. Despite the increasing number of studies, there is still a knowledge gap about the influence of management regimes on the diversity of plant-associated bacteria in grassland ecosystems. In this study, we gained new and interesting insights into the diversity of plant-associated bacteria in grassland ecosystems. All investigations in this study were carried out in the same area, the GrassMan experimental field in the Solling Uplands, central Germany. The GrassMan project was set up in 2008. It was conducted in a matrix of meadow plots at a permanent grassland site. The full-factorial design of GrassMan included two mowing frequencies (mowing once per year in July vs. mowing thrice per year in May, July, and September) and two fertilization treatments (no vs. fertilization with NPK). A third factor, the gradient of species richness, was manipulated by selective herbicide applications targeting either dicots or monocots. The first aim of this study was to investigate the effect of the different mowing and fertilization regimes onto the bacterial endophytic community in three grass species, Festuca rubra, Lolium perenne, and Dactylis glomerata, respectively. Therefore, tiller samples were taken from the dicot-reduced plots in September 2010 as well as in April, July, and September 2011. Total DNA was extracted from the collected samples and subjected to 16S rRNA gene PCRs. Community structures were assessed by DGGE-based analysis of the generated PCR products. We found differences in bacterial endophyte community structures with respect to the grassland management regimes investigated. While fertilizer application had a high impact onto endophytic diversity in both F. rubra and L. perenne, the endophytic community structure in D. glomerata was not influenced by this management regime. Moreover, tillers of L. perenne derived from unfertilized plots grouped in distinct clusters indicating a more similar bacterial community composition in these plots when analyzing for the influence of the mowing treatment. We also recorded a strong seasonal effect on community composition. As a consequence, both the season and the host plant have to be regarded in further studies as they might alter the effects of different grassland management regimes on endophytic bacterial community structures. The second aim of this study was to investigate the effect of above-ground herbivory on the bacterial community composition in the rhizosphere. Therefore, a lysimeter experiment was established in autumn 2010. Following a two-week exposure to herbivory by grasshoppers and snails, soil samples were collected from the lysimeters in summer 2011. To gain insights into the composition of the plant-associated bacterial communities in the rhizosphere, total DNA was extracted from the collected samples and subjected to 16S rRNA gene PCRs. Community structure were assessed either by DGGE analysis or pyrosequencing of the obtained PCR products. Whereas herbivory did not seem to affect the bacterial richness, slight changes in the relative abundances of certain bacterial groups were recorded. For example, an uncultured Acidobacterium was significantly affected by herbivory. As part of the lysimeter experiment, we also investigated the influence of sward composition and the different management regimes on the bacterial communities in the rhizosphere. Both the herbicide application and lower mowing frequencies decreased the bacterial richness in the rhizosphere. Moreover, no differences in bacterial richness between fertilized and unfertilized plots were recorded. Further analyses revealed that a variety of distinct bacterial groups and species in the rhizosphere do respond to the treatments studied. For example, the abundance of the Acidobacteria was significantly reduced in fertilized plots. The opposite was observed for the Actinobacteria. In conclusion, plant-associated bacteria in the endosphere and in the rhizosphere are affected by management regimes. Evaluating the impact of different grassland management regimes and above-ground herbivory onto plant-associated bacteria may results in a better understanding of the multitrophic interaction between plant species, bacterial communities, and above-ground herbivores. Furthermore, the results of this study will help to predict the impact of different grassland management regimes onto plant-associated bacterial communities and related effects on soil ecosystems.
Keywords: Metagenomics; Plant-associated bacteria; Microbial Ecology; Multitrophic Interactions
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In den vergangenen Jahren rückten Pflanzen-assoziierte Bakterien auf Grund ihrer Bedeutung für die Pflanzengesundheit und das ökologische Gleichgewicht zunehmend in den Fokus aktueller Forschungen. Trotz der stetig steigenden Zahl wissenschaftlicher Studien ist der Einfluss von Bewirtschaftungsmaßnahmen auf die Diversität dieser Bakteriengemeinschaften in Grünlandökosystemen ver-gleichsweise wenig untersucht. In dieser Studie haben wir neue und interessante Erkenntnisse über die Diversität von Pflanzen-assoziierten Bakterien in Grünlandökosystemen gewonnen.
Sämtliche Untersuchungen dieser Arbeit wurden auf der GrassMan-Fläche in den Mittelgebirgslagen des Solling in Deutschland durchgeführt. Das GrassMan-Experiment wurde 2008 in einer Matrix von Wiesenplots schachbrett-artig auf historisch altem Grünland errichtet. Die Bewirtschaftungsintensität unterschied sich bezüglich der Häufigkeiten (einmal jährlich im Juli oder dreimal jährlich im Mai, Juli und September) und der Düngung (keine Düngung bzw. Düngung mit NPK). Außerdem wurde durch gezielten Herbizid-Einsatz gegen Monokotylen oder gegen Dikotylen ein Gradient in der Anzahl der Pflanzenarten erzeugt.
Die Arbeit umfasst drei Hauptthemen. Erstens wurde der Einfluss verschiedener Bewirtschaftungsmaßnahmen auf die bakterielle Endophyten-gemeinschaft in den drei Grasarten Festuca rubra, Lolium perenne und Dactylis glomerata untersucht. Hierfür wurden im September 2010 und im April, Juli und September 2011 Pflanzenproben auf den Dikotylen-reduzierten Plots gesammelt. Die Umwelt-DNS wurde aus den Proben extrahiert und als Template für 16S PCRs eingesetzt. Die Struktur der bakteriellen Endophyten-Gemeinschaft wurde mittels DGGE-Analyse der erhaltenen PCR-Produkte untersucht.
Wir konnten Unterschiede der Endophyten-Gemeinschaftsstrukturen hinsichtlich der verschiedenen Bewirtschaftungsintensitäten feststellen. Während die Düngung einen starken Effekt auf die bakterielle endophytische Diversität sowohl in F. rubra als auch in L. perenne hatte, wurden die bakteriellen Endo-phyten in D. glomerata nicht dadurch beeinflusst. Die Proben von L. perenne, die von den ungedüngten Plots stammten, bildeten zudem eindeutige Gruppen bei der Analyse der DGGE-Banden bezüglich der zwei Schnitthäufigkeiten. Somit beeinflusste auch die Mahd die bakterielle Endophyten-Gemeinschaft in den Pflanzen. Weiterhin konnten wir einen starken saisonalen Effekt auf die Struktur der endophytischen Gemeinschaft nachweisen. Da saisonale Veränderungen und die Pflanzenart die Zusammensetzung der endophytischen Bakteriengemeinschaft beeinflussten, können sich die Auswirkungen unterschiedlicher Bewirtschaf-tungsintensitäten mit der Zeit und der untersuchten Pflanzenart verändern. Dieses Ergebnis sollte bei zukünftigen Studien berücksichtigt werden.
Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, wie sich oberirdische Herbivorie auf die Bakteriengemeinschaft in der Rhizosphäre auswirkt. Hierfür wurde im Herbst 2010 ein Lysimeter-Experiment auf der GrassMan-Fläche errichtet. Nach einer zweiwöchigen Herbivorie durch Grashüpfer und Schnecken im Sommer 2011 wurden Bodenproben von jedem Lysimeter genommen. Um Einblicke in die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaft in der Rhizosphäre zu erhalten, wurde die Gesamt-DNS aus den Bodenproben extrahiert und als Template in 16S rDNS PCRs eingesetzt. Die Gemeinschaftsstruktur wurde mittels DGGE-Analyse bzw. Pyrosequenzierung der erhaltenen PCR Produkte untersucht. Die Herbivorie hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Bakterien (richness), während leichte Änderungen in der relativen Abundanz von einigen Bakteriengruppen festgestellt wurden. So war zum Beispiel die relative Abundanz einer unkultivierten Acidobacterium-Art in den Herbivorie-Lysimetern erhöht.
Bestandteil des Lysimeter-Experiments war zudem die Untersuchung des Einflusses der Pflanzenartenanzahl und der verschiedenen Bewirtschaftungs-maßnahmen auf die bakterielle Gemeinschaft in der Rhizosphäre. Der Einsatz von Herbiziden und eine niedrigere Schnittfrequenz reduzierten die Artenanzahl (richness) der Bakterien in der Rhizosphäre. Die Düngung hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Arten. Weitere Analysen zeigten, dass eine Vielzahl von verschiedenen bakteriellen Taxa in der Rhizosphäre durch die untersuchten Maßnahmen beeinflusst wurde. So war die Abundanz der Acidobacteria in den gedüngten Plots signifikant geringer. Das Gegenteil trat bei den Actinobacteria auf.
Abschließend lässt sich sagen, dass Pflanzen-assoziierte Bakterien sowohl in der Endosphäre und Rhizosphäre durch Bewirtschaftungsmaßnahmen beeinflusst werden. Die Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Bewirtschaftungsintensitäten im Grünland und von oberirdischer Herbivorie auf Pflanzen-assoziierte Bakterien kann zu einem besseren Verständnis der multitrophischen Interaktionen zwischen Pflanzenart, Bakteriengemeinschaft und oberirdischen Herbivoren führen. Außerdem können uns die Ergebnisse dieser Arbeit helfen, die Effekte unterschiedlicher Bewirtschaftungsmaßnahmen auf Pflanzen-assoziierte Bakteriengemeinschaften und damit zusammenhängende Effekte auf das Bodenökosystem vorherzusagen.