| dc.contributor.advisor | Egner, Alexander PD Dr. | |
| dc.contributor.author | Krüger, Jennifer-Rose | |
| dc.date.accessioned | 2017-03-09T09:46:33Z | |
| dc.date.available | 2017-12-21T23:50:06Z | |
| dc.date.issued | 2017-03-09 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3DCD-B | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6182 | |
| dc.language.iso | eng | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 530 | de |
| dc.title | Tomographic STED Microscopy | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.contributor.referee | Enderlein, Jörg Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2017-02-22 | |
| dc.subject.gok | Physik (PPN621336750) | de |
| dc.description.abstractger | Die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie stellt eine der am meisten eingesetzten Methoden in den
Lebenswissenschaften dar, da sie einen nicht-invasiven Einblick in subzelluläre Strukturen ermöglicht.
Für mehr als ein Jahrhundert wurde die Beugungsgrenze als grundlegende Limitierung
der Auflösung erachtet. Innerhalb der letzten Jahrzehnte wurde diese Annahme durch die
Entwicklung von Hochauflösungs-Konzepten, basierend auf molekularen Übergängen zwischen
einem hellen und einem dunklen Zustand spezifischer Fluorophore, widerlegt. Bei der STED-
(Stimulated Emission Depletion) Mikroskopie wird der Anregungsfokus mit einer Intensitätsverteilung
überlagert, die die Fluoreszenz durch stimulierte Emission in den Bereichen auslöscht,
in denen ihre Intensität ungleich Null ist. Dieser Abregungsfokus weist für gewöhnlich eine
Donut-förmige Intensitätsverteilung auf, die eine simultane Auflösungserhöhung in alle lateralen
Richtungen ermöglicht. Die erzielbare Auflösungserhöhung ist theoretisch unbegrenzt und skaliert
mit der Laserleistung des Abregungsstrahls. Der Einsatz von hohen STED-Laserleistungen
kann allerdings zusätzliches Bleichen von Fluorophoren oder eine zusätzliche lichtinduzierte
Schädigung von Proben bewirken. Demzufolge besteht ein hoher Bedarf für STED-Mikroskope,
die bei niedrigeren Laserleistungen des Abregungsstrahls operieren und dabei die Auflösungsbedingungen
erhalten.
In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Variante der zweidimensionalen STED-Mikroskopie
vorgestellt, die auf der Anwendung eines eindimensionalen Abregungsfokus basiert. Im Gegensatz
zur klassischen STED-Implementierung wird die Laserleistung des Abregungsstrahls nicht
auf den Donut-förmigen Abregungsfokus verteilt, sondern entlang einer einzelnen Richtung konzentriert.
Aufgrund der daraus resultierenden höheren lokalen Intensitäten des Abregungsfokus
kann bei etwa der halben STED-Laserleistung die gleiche eindimensionale Auflösungserhöhung
erzielt werden wie in der konventionellen STED-Mikroskopie.
Um eine isotrope Auflösungserhöhung in alle lateralen Richtungen zu erhalten, muss eine Sequenz
von Bildern mit unterschiedlich orientierten Achsen der eindimensionalen Auflösungserhöhung
aufgenommen werden. Dafür wird das Abregungsmuster um eine Rotationsachse gedreht,
die senkrecht zur Fokalebene den Fokus zentral schneidet. Mittels geeigneter Rekonstruktionsalgorithmen
ist es möglich, die Auflösungserhöhung aus den Einzelbildern vollständig in ein
finales Bild mit annähernd isotroper Auflösung zu übertragen. Da die beschriebene Aufnahmeprozedur
Analogien zu tomographischen Konzepten aufweist, bezeichnen wir unsere neue
Methode als „tomographische STED-Mikroskopie“.
Neben der effizienteren eindimensionalen Auflösungserhöhung weist unsere neue STED-Variante
einen weiteren, intrinsischen Vorteil gegenüber klassischen Ansätzen auf: Durch das eindimensionale
Abregungsmuster wird die Fluoreszenz nur in eine Richtung eingeschränkt und somit
profitiert die tomographische STED-Mikroskopie im Vergleich zu der konventionellen STEDVariante
von einem höheren Fluoreszenz-Photonenfluss. Dieses zusätzliche Signal ist insbesondere
dann von Vorteil, wenn die gleiche oder sogar eine niedrigere Gesamtaufnahmezeit als in
der konventionellen STED-Mikroskopie angestrebt wird. Bezogen auf die Auflösung und das Signal kann mittels der tomographischen STED-Mikroskopie
die gleiche Bildqualität mit etwa der halben STED-Laserleistung und innerhalb gleicher oder
sogar kürzerer Aufnahmezeit realisiert werden. Dadurch hat unsere neue Methode das Potential,
das Bleichen von Fluorophoren und die lichtinduzierte Schädigung von Proben wesentlich zu
reduzieren und eröffnet somit neue Anwendungsfelder für die STED-Mikroskopie. | de |
| dc.description.abstracteng | Due to its non-invasive access to sub-cellular structures, far-field fluorescence microscopy constitutes
one of the most prevalent methods in the life sciences. For more than one century, it had
been common knowledge that the resolution is fundamentally limited by diffraction. Within the
last decades, this constraint has been repealed by super-resolution concepts based on molecular
transitions between a bright and a dark state of specific fluorophores. In STED (Stimulated
Emission Depletion) microscopy, the excitation focus is superposed with an intensity distribution
that depletes the fluorescence via stimulated emission wherever its intensity is non-zero.
The depletion focus is typically doughnut-shaped, allowing for a directly accessible resolution
enhancement in all lateral directions. The achievable resolution in STED microscopy is theoretically
unlimited and directly linked to the STED laser power, which already raises a concern:
The application of high depletion laser powers might induce additional photo-bleaching to fluorophores
or photo-damage to biological samples. Consequently, there is a great demand for
STED microscopes that operate at reduced depletion laser powers, while preserving resolution
conditions.
In the thesis presented here, a novel two-dimensional STED microscopy variant that bases on
the utilization of a one-dimensional depletion focus is introduced. Contrary to the classical implementation,
the STED laser power is not distributed to a doughnut-shaped depletion pattern
but concentrated along a single direction. Due to higher local intensities in the depletion pattern,
the same one-dimensional resolution enhancement as in the conventional STED approach
can be obtained at approximately half the depletion laser power.
For an isotropic resolution enhancement in all lateral directions, a sequence of images with
differently oriented high-resolution axes has to be recorded. Therefore, the one-dimensional
depletion pattern has to be rotated along a rotary axis that is perpendicular to the focal plane
and intersects with the focal center. Via appropriate reconstruction algorithms, it is possible to
transfer the high-resolution information of each individual frame of one-dimensional resolution
enhancement to a final image with quasi-homogeneous resolution. Since the outlined image
acquisition and processing is reminiscent of tomographic approaches, our method is referred to
as ‘tomographic STED microscopy’.
Besides the more efficient resolution enhancement along one direction, our new STED variant
contains a further intrinsic advantage when compared to classical approaches. As the fluorescence
is only constrained along one dimension, tomographic STED microscopy profits from a
higher flux of fluorescence photons as compared to the conventional STED variant which is
particularly advantageous when choosing the same or even a shorter total recording time.
Since an image of same quality, in terms of resolution and signal, can be obtained with half
the STED laser power and within equal or even lower total acquisition time when compared to
the classical approach, tomographic STED microscopy has the potential to substantially reduce
photo-bleaching and photo-damage. Our new STED variant thereby paves the way towards
new fields of applications for STED microscopy. | de |
| dc.contributor.coReferee | Egner, Alexander PD Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Köster, Sarah Prof. Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Moser, Tobias Prof. Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Rehfeldt, Florian Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Salditt, Tim Prof. Dr. | |
| dc.subject.eng | Fluorescence microscopy | de |
| dc.subject.eng | Superresolution techniques | de |
| dc.subject.eng | STED microscopy | de |
| dc.subject.eng | PSF engineering | de |
| dc.subject.eng | Biophysics | de |
| dc.subject.eng | Cell imaging | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3DCD-B-9 | |
| dc.affiliation.institute | Fakultät für Physik | de |
| dc.description.embargoed | 2017-12-21 | |
| dc.identifier.ppn | 881842605 | |