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Einfluss des Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne 2-Enzyms auf die Migration der myeloischen Zelllinien RAW und J774

dc.contributor.advisorKatschinski, Dörthe Prof. Dr.
dc.contributor.authorSteinhardt, Maximilian Johannes
dc.date.accessioned2017-04-11T09:00:41Z
dc.date.available2017-05-03T22:50:10Z
dc.date.issued2017-04-11
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3E11-9
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-6238
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610de
dc.titleEinfluss des Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne 2-Enzyms auf die Migration der myeloischen Zelllinien RAW und J774de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedInfluence of the Prolyl-4-Hydroxylase-Domain 2 Enzyme on migration of the myeloid cell lines RAW and J774de
dc.contributor.refereeKehlenbach, Ralph Prof. Dr.
dc.date.examination2017-04-26
dc.description.abstractgerHIF-1 ist ein unabdingbarer Transkriptionsfaktor für die Makrophagenfunktion, da diese zu großen Teilen in hypoxischen Geweben stattfindet. Seine alpha-Untereinheit wird von Prolyl-4-Hydroxylase-Domäne-Enzymen sauerstoffabhängig für den proteasomalen Abbau markiert, weswegen HIF-1α unter Sauerstoffmangel stabilisiert wird und daher eine verstärkte transkriptionelle Aktivität zeigt. Der Hauptmediator der HIF-1-Hydroxylierung ist PHD2, dessen Funktion noch nicht abschließend verstanden ist, da es Hinweise auf HIF-1-unabhängige Effekte gibt. Um die Rolle von PHD2 in Makrophagen besser zu verstehen, wurde der Effekt eines PHD2-knockdowns in den Makrophagenzelllinien RAW und J774 auf die Migration der Zellen untersucht. Zunächst wurden durch Einbringen von shRNA über einen lentiviralen Vektor ein PHD2-knockdown sowie ein Kontrollklon beider Zelllinien erstellt. Der erfolgreiche knockdown wurde auf Proteinebene mittels Western Blot und auf RNA-Ebene über RT qPCR auch auf RNA Ebene nachgewiesen. Darauf wurde die RNA-Expression der RAW- und J774-Zelllinien von HIF-1 Zielgenen mittels qPCR gemessen. Hier zeigte sich auch bei Makrophagen das bei anderen Zelllinien beschriebene vermehrte Vorkommen von VEGF, PHD3 und GLUT-1 -mRNA. Im Boyden Chamber Assay zeigte sich keine PHD2-abhängige Beeinflussung der Migration. Im Scratch Assay fand sich bei den RAW-Zellen eine verzögerte Wiederbesiedelung der freien Fläche bei unveränderter Verdopplungszeit. Hierauf wurde eine Rekonstitution der knockdown-Zellen durch virale Retransfektion eines Plasmids, das die kodierende Sequenz der humanen PHD2 enthält, durchgeführt. Der vermutete PHD2-abhängige Effekt konnte dadurch rückgängig gemacht werden. Mikroskopisch zeigte sich nach Zählung der Pseudopodien eine PHD2-abhängige Beeinflussung der Zellmorphologie. Diese kann ein Hinweis auf eine HIF-1- oder PHD2-abhängige Beeinflussung des Zytoskeletts sein. Da das Zytoskelett nicht nur für die Migration eine wichtige Rolle spielt, sondern auch eine grundlegende Bedeutung in der Zelladhäsion hat, ist nicht auszuschließen, dass die Verminderung der Adhäsionsfähigkeit durch einen PHD2-knockdown Ursache der beobachteten Effekte ist. Daher müssen die hier gezeigten Daten zu Makrophagen durch Migrationsstudien unter Hyp- und Normoxie und kombiniertem PHD2- und HIF-1-knockdown ergänzt werden und die zytoskelettspezifischen, PHD2-abhängigen molekularen Veränderungen gefunden werden. Dann erst können die HIF-1- und PHD2-abhängigen Effekte in Krankheitsprozessen besser verstanden werden.de
dc.description.abstractengHIF-1 is an essential transcription factor for macrophage function, as it usually takes place in hypoxic tissues. It's alpha-subunit is marked oxyxen-dependendly for proteasomal degradation, leading to hypoxic HIF-1alpha stabilisation and increased transcriptional activity. The most important mediator of HIF-1 hydroxylation is PHD2, whose function is not completely understood yet, as there are implications for HIF-1 Independent effects. To understand the role of PHD2 in macrophages better, we investigated the effect of a PHD2-knockdown in the murine macrophage cell lines RAW and J774. By lentiviral vector insertion of shRNA, a PHD2-knockdown and a control clone of both cell lines was created. Succesful knockdown was confirmed via western blot on protein level and via RT-qPCR on RNA level. Then, we quantified RNA-expression of HIF-1 target genes in RAW and J774 cell lines via qPCR. Here, increased abundance of VEGF, PHD3 and Glut-1 mRNA could be confirmed for macrophages after being described for other cell lines. Boyden Chamber Assay showed no PHD2-dependent change in macrophage migration. Scratch Assay showed a delayed repopulation of free areas at unchanged cell doubling time for RAW cells. Via lentiviral retransfection of the coding sequence for human PHD2 the effect could be reversed. Visually, pseudopodial counts revealed a PHD2-dependent influence on cell morphology. This can be a clue for HIF-1 or PHD2-dependent cytoskeletal changes. As the cytoskeleton is not only important for migration, but also has fundamental influence oh cell adhesion, an impairing effect on adhesion could be the cause for the observed effects. Thus, the data on macrophage migration shown here should be completed with migratory studies on both PHD2 and HIF-1 depleted cells in normoxia and hypoxia. Furthermore, cytoskeleton-specific molecular changes on PHD2 knockdown should be searched for. Only then HIF-1 and PHD2- dependent effects in pathopysiology can be understood better.de
dc.contributor.coRefereeSchön, Margarete Prof. Dr.
dc.subject.gerMakrophagende
dc.subject.gerMigrationde
dc.subject.gerAdhäsionde
dc.subject.gerScratch Assayde
dc.subject.gerBoyden Chamberde
dc.subject.gerHypoxiede
dc.subject.gerHIFde
dc.subject.gerPHD2de
dc.subject.engMacrophagesde
dc.subject.engMigrationde
dc.subject.engScratch Assayde
dc.subject.engBoyden Chamberde
dc.subject.engHypoxiade
dc.subject.engHIFde
dc.subject.engPHD2de
dc.subject.engAdhesionde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3E11-9-9
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullPhysiologie / Pathophysiologie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875283)de
dc.description.embargoed2017-05-03
dc.identifier.ppn884378942


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