The signal transduction of synapse formation and it's failure in Rett syndrome

by René Ebrecht
Doctoral thesis
Date of Examination:2016-05-12
Date of issue:2017-04-26
Advisor:Prof. Dr. Fred Wouters
Referee:Prof. Dr. Till Marquardt
Referee:Prof. Dr. Jörg Enderlein
Referee:Prof. Dr. Michael Hörner
Referee:Prof. Dr. Nils Brose
Referee:Prof. Dr. Thomas Dresbach
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6271

 

 

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Abstract

English

The mechanistic target of rapamycin (mTOR) perceives and integrates various extracellular and intracellular signals and regulates cellular growth and homeostasis. The evolutionary conserved serine/threonine kinase can form two functionally and structurally distinct complexes, mTORC1 and mTORC2. Regulation of these complexes occurs through levels of glucose and amino acids, energy levels, hormones, growth factors and neurotransmitters. mTOR regulates mRNA translation, lipid biosynthesis, auto- and mitophagy, and lysosome biogenesis. Signalling pathways that are regulated by mTOR are involved in integrated processes of neuronal development, synapse formation and plasticity, memory and cognition. Brain-related alterations in mTOR signalling are connected to pathological conditions like epilepsy, depression, autism, schizophrenia, Alzheimer's and Parkinson's disease. While some aspects of mTOR signalling, like the regulation of mRNA translation, are well understood, others remain loosely defined. We have therefore developed two quantitative optical tools that analyse the endogenous activity of mTORC1 and mTORC2. We use antibodies in ratiometric FRET assays to quantify activity states of both mTOR complexes. The application of these assays to neurons from MeCP2-KO mice, a mouse model of Rett syndrome, a severe neurodevelopmental disorder, confirmed a reduced mTORC1 activity in MeCP2-KO neurons. These experiments also suggested a neuron-specific reduction of mTORC1 activity as well as a general reduction in mTORC2 signalling. These impairments may represent a reason for the observed reduced number of synapses in Rett syndrome. The interaction of mTOR with gephyrin, the major organiser of the inhibitory postsynapse, has been described in the past. This interaction has the potential to regulate inhibitory synapse formation and plasticity by localised protein translation at the inhibitory postsynapse. We developed a FRET assay that confirmed the interaction between mTOR and gephyrin. We found that gephyrin exclusively interacted with mTORC1, and that serine 270 of gephyrin is an important determinant of this interaction. Serine 270 is a target of GSK-3β and CDK5 in the brain, which seem to play opposing roles in the regulation of synapse formation. The GSK-3β/CDK5 mediated recruitment of mTORC1 to the postsynaptic gephyrin network may represent a mechanism for regulating synapse formation and plasticity. In order to organise the inhibitory postsynapse, gephyrin forms a 2-dimensional network underneath the synaptic membrane. Synaptic adhesion molecules and inhibitory neurotransmitter receptors interact with the gephyrin network and are organised by it. We developed two FRET assays that measure the formation of the gephyrin network. We demonstrate that inhibition of mTORC1 promotes the formation of the gephyrin network at GABAergic postsynaptic sites. This may represent a regulatory mechanism for inhibitory synapse formation and plasticity.
Keywords: Neuroscience; FRET Microscopy; FLIM; Rett syndrome; mTOR; Gephyrin; Time correlated single photon counting

German

Das Protein mechanistic target of rapamycin (mTOR) empfängt und integriert vielfältige extrazelluläre sowie intrazelluläre Signale und reguliert zelluläres Wachstum und Homöostase. Es handelt sich um eine evolutionär konservierte Serin/Threonin Kinase, die zwei strukturell und funktionell unterschiedliche Komplexe bildet, mTORC1 und mTORC2. Die Regulation dieser Komplexe erfolgt durch Nährstoffe, wie Glukose und Aminosäuren, den Energiegehalt der Zelle, Hormone, Wachstumsfaktoren sowie Neurotransmitter. mTOR reguliert die mRNS-Translation, die Lipidbiosynthese, die Auto-/Mitophagie und die Lysosombildung. Signalwege die durch mTOR reguliert werden umfassen integrierte Prozesse wie die neuronale Entwicklung, Synapsenbildung und -plastizität, Erinnerung und Wahrnehmung. Veränderungen der mTOR Signalgebung im Gehirn stehen mit pathologischen Zuständen wie Epilepsie, Depressionen, Autismus, Schizzophrenie, Alzheimer und der Parkinson Krankheit in Verbindung. Während einige Aspekte der mTOR Signalgebung gut bestimmt sind, sind andere kaum definiert. Wir haben deshalb quantitative optische Werkzeuge entwickelt die die Analyse der mTORC1- sowie mTORC2-Aktivität erlauben. Wir benutzen Antikörper in ratiometrischen FRET-Analyse0 um die Aktivitätszustände von mTOR zu messen. Die Anwendung dieser Analysen in Neuronen aus MeCP2 knockout Mäusen, einem Mausmodell des Rett-Syndroms, konnten bestätigen, das die mTOR-Aktivität in den Gehirnen dieser Mäuse reduziert war. Diese Experimente deuteten außerdem eine neuron-spezifische Reduzierung der mTORC1-Aktivität, sowie eine allgemeine Verringerung der mTORC2-Aktivität an. Diese Veränderungen könnten einen Grund für die beobachtete reduzierte Anzahl von Synapsen bei Rett Mäusen darstellen. Die Interaktion von mTOR und Gephyrin, dem wichtigsten Organisator der inhibierenden Postsynapse, wurde bereits in der Vergangenheit beschrieben. Diese Interaktion hat das Potenzial, die Bildung und Plastizität inhibitorischer Synapsen durch lokale Proteintranslation zu bestimmen. Wir entwickelten eine FRET Analyse welche die Interaktion zwischen mTOR und Gephyrin auf Einzelzellniveau zeigt und quantifiziert. Wir konnten zeigen, das Gephyrin exklusiv mit mTORC1 interagiert und das Serin 270 in Gephyrin eine wichtige Rolle für die Interaktion mit Gephyrin spielt. Um die hemmende Postsynapse zu organisieren, bildet Gephyrin ein zweidimensionales Netzwerk unter der postsynaptischen Membran. Synaptische Adhäsionsmoleküle und hemmende Neurotransmitter-Rezeptoren interagieren mit diesem Netzwerk. Wir entwickelten zwei FRET-Analysen, welche die Bildung des Netzwerkes quantitativ bestimmen können. Damit konnten wir zeigen, das die Vernetzung durch Hemmung von mTORC1 befördert wird. Dies stellt möglicherweise einen neuen Regulationsmechanismus der Synapsenbildung und Plastizität dar.
 
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