Expression von Aufnahme-Transportern für Zytostatika in Mamma- und Prostatakarzinom-Zellen und ihre Interaktion mit Zytostatika

Müller, Judith

dc.contributor.advisor	Hagos, Yohannes Prof. Dr.
dc.contributor.author	Müller, Judith
dc.date.accessioned	2017-06-27T09:18:04Z
dc.date.available	2017-06-27T09:18:04Z
dc.date.issued	2017-06-27
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3E8D-4
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6361
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc	610
dc.title	Expression von Aufnahme-Transportern für Zytostatika in Mamma- und Prostatakarzinom-Zellen und ihre Interaktion mit Zytostatika	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Expression of uptake-transportproteins for antineoplastic drugs in cell lines from mamma and prostate carcinoma	de
dc.contributor.referee	Burckhardt, Gerhard Prof. Dr.
dc.date.examination	2017-06-12
dc.description.abstractger	Die Solute-Carrier-Transporter (SLC-Transporter) gehören zur großen Gruppe von integralen Membranproteinen und realisieren den Stofftransport über die Zellmembran. Die Interaktion von therapierelevanten Zytostatika und Adjuvantien mit SLC-Transportern und ihre Expression in Zelllinien aus Prostata- und Mammakarzinom-Gewebe ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit, welche aus zwei Projektteilen besteht. Im ersten Abschnitt wurden vier SLC-Transporter auf ihre Interaktion mit 26 therapierelevanten Zytostatika und Adjuvantien untersucht. Im zweiten Teil wurde die Expression von 46 SLC-Transportern in Zelllinien aus Prostata- und Mammakarzinomen analysiert. Für die Interaktionsanalyse mit Zytostatika und Adjuvantien wurden die Peptidtransporter PEPT1 (SLC15A1) und PEPT2 (SLC15A2), der L-Carnitin-Transporter OCTN2 (SLC22A5) und der nierenspezifische „Multidrug and toxin extrusion“-Transporter MATE2-K (SLC47A2) in stabil transfizierten, humanen, embryonalen Nierenzellen verwendet. Gemessen wurde hierbei die Aufnahme eines transporterspezifischen, [3H]-markierten Substrats in Ab- oder Anwesenheit von je 100 µM der Testsubstanzen. Diejenigen Substanzen, die eine Reduktion der Aufnahme des Referenzsubstrats um mindestens 50 % bewirkten, wurden für eine Affinitätsanalyse ausgewählt. Diese erfolgte in Form der Ki-Wert-Bestimmung mit Hilfe des Dixon-Plots. Darüber hinaus wurde, durch Vergleich mit Ergebnissen aus dem Cornish-Bowden-Plot, eine Abschätzung über die Inhibitionskinetik der betreffenden Substanzen vorgenommen. Für PEPT1 konnte keine Substanz mit inhibitorischer Wirkung ermittelt werden. PEPT2 zeigte in Anwesenheit des Mitose-Inhibitors Paclitaxel und des Topoisomerase-Inhibitors Etoposid eine verringerte Aufnahme des markierten Substrates. Für diesen Transporter wurde keine Affnitätsanalyse durchgeführt. Der L-Carnitin-Transporter OCTN2 zeigte eine deutlich verringerte Aufnahme von markiertem Substrat in Anwesenheit von Paclitaxel, Etoposid, Vinblastin und Vincristin. Die Ki-Werte lagen bei 4,6 ± 0,3 µM, 51,0 ± 5,3 µM, 52,3 ± 5,2 µM bzw. 52,5 ± 5,9 µM. Der Vergleich des Dixon-Plots mit dem Cornish-Bowden-Plot ergab für Paclitaxel und Etoposid keinen Hinweis auf eine kompetitive Hemmung. Für die Vincaalkaloide Vinblastin und Vincristin ergab sich dagegen eine kompetitive Inhibition von OCTN2. Für MATE2-K konnte ein inhibitorischer Effekt unter Zugabe von Mitoxantron (Ki = 1,3 ± 0,4 µM), Irinotekan (Ki = 7,4 ± 1,3 µM), Paclitaxel (Ki = 28,6 ± 5,3 µM), Doxorubicin (Ki = 52,3 ± 5,1 µM), Vinblastin (Ki = 91,0 ± 8,1 µM) und Etoposid (Ki = 107,1 ± 4,4 µM) gezeigt werden. Eine kompetitive Inhibition wurde für Paclitaxel, Doxorubicin und Etoposid festgestellt. Die Ergebnisse der Analyse der übrigen Substanzen lassen eine gemischte Inhibition vermuten. Die Analyse der SLC-Transporter-Expression in Prostata- und Mammakarzinom-Zelllinien wurde in Kooperation mit dem Deutschen Primaten Zentrum mittels Chip-PCR durchgeführt. Zur Kontrolle wurde kommerziell erworbene Gesamt-RNA von Nieren, Leber und Colon mitgeführt. Eine besonders starke Expression auf mRNA-Ebene konnte für den Thiamin-Transporter THTR1, die Monocarboxylat-Transporter MCT1 und MCT8, den noch wenig erforschten ORCTL2, den L-Carnitin-Transporter OCTN2 und die Nukleosid-Transporter ENT2 und 3 beobachtet werden. Eine etwas geringere Expression wurde für den Monocarboxylat-Transporter MCT4, den Ergothionein-Transporter OCTN1, den Prostaglandin-Transporter OATP2A1, den Aminosäure-Transporter LAT2, den Transporter organischer Kationen OCT1 und den Schilddrüsenhormon-Transporter OATP4A1 gezeigt. Die übrigen SLC-Transporter waren weniger stark bis sehr gering exprimiert. Zur Überprüfung der funktionellen Expression wurden Transportexperimente mit je einer exprimierenden und einer nicht-exprimierenden Zelllinie von Mamma- bzw. Prostatakarzinom-Zelllinien durchgeführt. Für die fünf in Prostatakarzinom-Zelllinien getesteten Transporter OAT4, OATP1B3, OATP2B1, NaCT und MATE1 konnte keine funktionelle Expression nachgewiesen werden. Die in Mammakarzinom-Zelllinien getesteten Transporter waren OCT2, OATP1B3, NaCT, PEPT1 und MATE1. Hier konnte für OCT2 und PEPT1 ein spezifisch inhibierbarer Transport des Modellsubstrats und damit eine funktionelle Expression nachgewiesen werden. Die Kenntnis über die Interaktion von Zytostatika mit SLC-Transportern und ihre Expressionsmuster in Tumorgewebe könnte für die medikamentöse Therapie von Bedeutung sein. Hierzu müsste zunächst geklärt werden, ob Zytostatika von den SLC-Transporten in die Zelle aufgenommen werden. Dessen ungeachtet könnten Zytostatika mit endogenen oder therapeutisch eingesetzten Substanzen an SLC-Transportern wechselwirken. Dies könnte sowohl zu veränderten Wirkspiegeln im Patienten-Plasma als auch zur Schädigung von Leber oder Nieren führen, wenn es in diesen Organen zur Akkumulation toxischer Substanzen kommt.	de
dc.description.abstracteng	The solute carrier (SLC) transporters form a large family of membrane proteins that translocate dissolved substances across cell membranes. The first part of this work investigates the interaction of 26 commonly used antineoplastic drugs and adjuvants with four SLC-transporters. The second part is concerned with the expression pattern of 46 SLC-transporters in established cell lines from six mamma and three prostate carcinoma cell lines. For interaction analysis the peptide transporters PEPT1 (SLC15A1), PEPT2 (SLC15A2), the L-carnitine transporter OCTN2 (SLC22A5), and the kidney specific “multidrug and toxin extrusion” transporter MATE2-K (SLC47A2) stably expressed in HEK293-cells were chosen. The uptake of transporter-specific [3H]-labeled substrates was quantified in presence and absence of 100 µM of each test compound. Antineoplastic drugs and adjuvants that reduced uptake of [3H]-labeled substrate by at least 50% were chosen for affinity analysis and further characterization of their inhibition type. For this purpose, Ki-values were calculated using Dixon-plot analysis. The inhibition type was determined by comparing the results obtained in Dixon and in Cornish-Bowden-plots. No interaction with any of the substances tested was observed for PEPT1. PEPT2 showed reduced [3H]Gly-Sar-uptake in presence of the mitotic inhibitor paclitaxel (reduction by 63,8%) and the inhibitor of topoisomerases, etoposide (reduction by 40%), but inhibition kinetics were not determined. For the L-carnitine transporter OCTN2 a reduction in [3H]-labeled substrate was found for paclitaxel, etoposide, vinblastine, and vincristine with Ki-values of 4.6 ± 0.3 µM, 51.0 ± 5.3 µM, 52.3 ± 5.2 µM and 52.5 ± 5.9 µM, respectively. Comparison of Dixon-plots with Cornish-Bowden-plots showed a competitive type of inhibition for the vinca alkaloids vinblastine and vincristine, but no determinable type of inhibition for paclitaxel and etoposide. MATE2-K was inhibited by at least 50% of [3H]MPP-uptake in presence of mitoxantrone (Ki = 1.3 ± 0.4 µM), irinotecan (Ki = 7.4 ± 1.3 µM), paclitaxel (Ki = 28.6 ± 5.3 µM), doxorubicin (Ki = 52.3 ± 5.1 µM), vinblastine (Ki = 91.0 ± 8.1 µM), and etoposide (Ki = 107.1 ± 4.4 µM). Competitive inhibition at MATE2-K was found for paclitacel, doxorubicin and etoposide. The remaining cytostatics revealed a mixed type of inhibition. The expression analyses of SLC-transporters in cell lines of mamma and prostate carcinoma was carried out in cooperation with the German Primate Center, using a realtime-PCR Chip-system. As an expression control total RNA of human kidney, liver, and colon was analyzed under conditions identical to those applied to the carcinoma cells. The strongest expression throughout all carcinoma cell lines was detected for the thiamine transporting protein THTR1, the monocarboxylate transporters MCT1 and MCT8, the orphan transporter ORCTL2, the L-carnitine transporter OCTN2, and the nucleoside transporters ENT2 and ENT3. Slightly lower expression levels were detected for the monocarboxylate transporter MCT4, the ergothioneine transporter OCTN1, the prostaglandin transporter OATP2A1, amino acid transporter LAT2, transporter of organic cations OCT1, and the thyroid hormone transporter OATP4A1. All remaining SLC transporters showed a very low or no detectable expression. For the investigation of functional expression, transporters with heterogeneous expression within the same cell type (mamma or prostate) were chosen for uptake experiments. The uptake of transporter-specific, labeled substrate was quantified comparing the uptake of transporter-RNA expressing cells with that of non-expressing cells in presence and absence of transporter-specific inhibitors. For prostate carcinoma cell lines no functional expression was observed for OAT4, OATP1B3, OATP12B1, NaCT, and MATE1. Among the tested SLC-transporters of mamma carcinoma cell lines were OCT2, OATP1B3, NaCT, PEPT1, and MATE1 out of which OCT2 and PEPT1 showed distinct functional expression. The knowledge about the interaction of SLC-transporters with antineoplastic drugs and their expression pattern in carcinoma cells should be beneficial for the design of a tailored chemotherapy. Therefore, in future experiments, it has to be investigated whether inhibiting drugs are actually taken up by the transporters in question. A remaining concern is the ability of inhibiting drugs to cause drug-drug-interaction (DDI) with other substrates at their respective target transport protein. These DDIs could lead to impaired excretion of endogenous substances or drugs when administered in combination, resulting in changes of plasma concentration and potential kidney and liver toxicity.	de
dc.contributor.coReferee	Schwappach, Blanche Prof. Dr.
dc.subject.ger	SLC-Transporter	de
dc.subject.ger	Zytostatika	de
dc.subject.ger	Mammakarzinom	de
dc.subject.ger	Prostatakarzinom	de
dc.subject.ger	PEPT1	de
dc.subject.ger	PEPT2	de
dc.subject.ger	MATE2-K	de
dc.subject.ger	OCTN2	de
dc.subject.ger	SLC15A1	de
dc.subject.ger	SLC15A2	de
dc.subject.ger	SLC22A5	de
dc.subject.ger	SLC47A2	de
dc.subject.eng	SLC-transporter	de
dc.subject.eng	mamma carcinoma	de
dc.subject.eng	prostate carcinoma	de
dc.subject.eng	antineoplastic agents	de
dc.subject.eng	SLC22A5	de
dc.subject.eng	SLC47A2	de
dc.subject.eng	SLC15A1	de
dc.subject.eng	SLC15A2	de
dc.subject.eng	PEPT1	de
dc.subject.eng	PEPT2	de
dc.subject.eng	OCTN2	de
dc.subject.eng	MATE2-K	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3E8D-4-2
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät
dc.subject.gokfull	Medizin (PPN619874732)	de
dc.subject.gokfull	Pharmakologie / Toxikologie / Pharmakotherapie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN61987550X)	de
dc.identifier.ppn	89106169X

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Molekulare Medizin [242]

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