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Crosstalk of macrophages and endothelial cells in endothelial-to-mesenchymal transition and cardiac fibrosis

dc.contributor.advisorZeisberg, Elisabeth Prof. Dr.
dc.contributor.authorSánchez Sendín, Elisa
dc.date.accessioned2017-07-27T08:46:33Z
dc.date.available2017-07-27T08:46:33Z
dc.date.issued2017-07-27
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3EB7-4
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-6408
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610
dc.titleCrosstalk of macrophages and endothelial cells in endothelial-to-mesenchymal transition and cardiac fibrosisde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeLutz, Susanne Prof. Dr.
dc.date.examination2017-06-26
dc.description.abstractgerDie kardiale Fibrose ist eine zentrale Komponente nahezu aller chronischer Herzerkrankungen. Diese manifestiert sich als eine Akkumulation von Extrazellulärmatrix im Myokard. Diese Deposition extrazellulärer Matrix im Interstitium und perivaskulären Arealen hat ungünstige Konsequenzen für das Herz: es versteift den Herzmuskel und verursacht ein progressives myokardiales Remodelling als wichtiges Phänomen des Herzversagens unabhängig von dessen Ursache. Extrazellulärmatrix wird hierbei insbesondere von kardialen Fibroblasten gebildet, welches direkt zur kardialen Fibrose durch deren Aktivierung und Transdifferenzierung zu Myofibroblasten beiträgt. Diese kardialen Myofibroblasten nehmen somit eine Schlüsselrolle bei Herzfibrose ein und sind durch vermehrte proliferative Aktivität charakterisiert. Kardiale Fibroblasten sind eine heterogene Population, welche in der Herzentwicklung vom Epikard und Endokard abstammen. Die sog. endothelial-mesenchymale Transition (EndMT) beschreibt hierbei einen Prozess der Transdifferenzierung von endothelialen Zellen hin zu Zellen mit mesenchymalem Phänotyp, ein Prozess der in der Herzentwicklung mesenchymale Zellen zur Anlage der Herzklappen generiert. Im adulten Herzen spielt EndMT bei Herzerkrankungen ein Rolle und trägt durch dessen Aktivierung zum Fibroblastenpool und Fibrose bei. Somit kann eine Aktivierung von EndMT in multiplen murinen Modellen der Herzfibrose wie Angiotensin II-Infusion, Aortenstenose und myokardialer Ischämie beobachtet werden und produziert neue aktivierte Myofibroblasten mit endothelialem Ursprung, wie von zahlreichen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte. Stimuli wie Hypoxie, TGF-beta und inflammatorische Zytokine, welche im kranken Herzen induziert werden, sind bekannte Mediatoren von EndMT in vitro. Dagegen sind die zellulären Ursachen solcher Stimuli nur wenig charakterisiert. Eine weitere Komponente von Fibrose ist die assoziierte Inflammation. Jeder Organschaden vermittelt eine inflammatorische Antwort des Immunsystems, um Heilung zu vermitteln und Homöostase wiederherzustellen. Makrophagen sind Zellen myeloischen Ursprungs, welche im Herzen präsent sind und bei pathologischen Insulten vermehrt rekrutiert werden. Deren spezialisierte Funktionen sind kritische Komponenten für Heilungsprozesse im Herzen: diese phagozytieren Zellschrott und modulieren die inflammatorische Antwort durch Sekretion von Zytokinen; Makrophagen können aber auch Inflammation durch anti-inflammatorische und fibrotische Wachstumsfaktoren auflösen. Aufgrund der zahlreichen Funktionen von Makrophagen lassen sich diese in Subtypen unterteilen. Eine einfache Unterteilung ist hierbei die Trennung in die beiden Hauptgruppen "M1" als pro-inflammatorische und "M2" als anti-inflammatorische Makrophagen. Aufgrund derer kritischen Funktionen bei sowohl Inflammation und Reparaturprozessen vermuteten wir, dass Makrophagen eine Rolle auch bei EndMT im Herzen spielen könnten. Wir konnten zeigen, dass Makrophagen in fibrotischen Arealen humaner Herzen nach myokardialer Ischämie, bei Aortenstenose und diabetischer Kardiomyopathie akkumulieren. Dies konnte in den Mausmodellen der Aortenstenose und der Angiotensin II-Infusion bestätigt werden. Zudem konnten wir etablieren, dass Makrophagen mit EndMT Zellen räumlich assoziiert sind. Um einen direkten Zusammenhang zwischen Makrophagen und EndMT zu etablieren, generierten wir murine Makrophagenzelllinien, charakterisierten residente Peritonealmakrophagen und polarisierten Makrophagen aus dem Knochenmark bzw. die Makrophagen Zelllinie RAW264.7. Zudem etablierten wir 3 in vitro Zellkultursysteme, um unidirektionale bzw. bidirektionale parakrine sowie juxtakrine Effekte zwischen endothelialen Zellen und Makrophagen zu untersuchen. Als Kontrolle wurde EndMT in murinen kardialen Endothelzellen mit TGF-beta und inflammatorischen Zytokinen induziert. Wir konnten zeigen, dass Makrophagen tatsächlich EndMT in Endothelzellen durch juxtakrine Zellinteraktion vermitteln können, allerdings nicht unter parakrinen Konditionen. Interessanterweise konnten wir zudem etablieren, dass pro-inflammatorische Makrophagen aus dem Knochenmark verglichen mit nativen und anti-inflammatorischen Makrophagen aus dem Knochenmark nach TLR-Stimulation vermehrt EndMT induzieren. Dies konnte auch für pro-inflammatorische RAW264.7-Zellen gezeigt werden. Zudem war EndMT durch inflammatorische RAW264.7-Zellen mit einer Induktion der Notch-Signalkaskade, die auch in EndMT-Induktion in der Embryonalentwicklung involviert ist, assoziiert. Umgekehrt konnte gezeigt werden, dass EndMT-Zellen die Aktivierung von Makrophagen durch Repression der pro-inflammatorischen Marker TNF-alpha, MHCII und CCL2 in parakriner Weise hemmen. Zudem hemmte EndMT auch anti-inflammatorische und pro-fibrotische Marker in Makrophagen. Zusammenfassend beschreibt diese PhD-Arbeit die Wechselwirkung zwischen Makrophagen und kardialen Endothelzellen, welche EndMT durchlaufen.de
dc.description.abstractengCardiac fibrosis (CF) is an integral component of virtually all forms of chronic cardiac disease. CF manifests as an accumulation of excessive extracellular matrix (ECM) components throughout the myocardium. Aberrant deposition of fibres through the interstitium and perivascular areas have structural and functional deleterious consequences for the heart: it stiffens the cardiac muscle and causes progressive adverse myocardial remodelling; a pathological hallmark of the failing heart irrespective of its etiologic origin. Cells in charge of ECM homeostasis are cardiac fibroblasts, which directly contribute to cardiac fibrosis due to their activation and transformation to cardiac myofibroblasts upon injury. Cardiac myofibroblasts are therefore key mediators that actively divide and produce excessive ECM. Cardiac fibroblasts are a heterogenous population, known to be derived from the epicardium and the endocardium in the developing heart. Endothelial-to-Mesenchymal Transition (EndMT) describes the process of endothelial cell transformation to a mesenchymal phenotype, a process that occurs during cardiac development in order to give rise to the mesenchymal cells that form the primordia of the valves. In the adult diseased heart, EndMT is activated and contributes to the total pool of fibroblasts that are responsible for fibrotic disease. Thus, diverse models of murine cardiac fibrosis such as Angiotensin II infusion, aortic banding and myocardial infarction (MI) develop fibrosis and exhibit newly activated fibroblasts with endothelial origin, as shown by several groups. Injury signals such as hypoxia, TGF-beta and inflammatory cytokines are known inducers of in vitro EndMT. Cellular sources of such signals are not well characterised. Inflammation is another facet of disease that that consistently coexists with fibrosis. Every tissue injury triggers an inflammatory response by the innate immune system that aims to heal and re-establish homeostasis. Macrophages are myeloid cells present at the steady-state heart and are highly recruited upon pathological insult. Their specialised functions are critical for the healing heart: they phagocyte cardiomyocyte debris and modulate inflammation by secreting inflammatory cytokines; but also, they drive inflammation resolution by releasing anti-inflammatory cytokines and fibrotic factors. Macrophages are able to display a wide range of features and therefore can be subdivided in a spectrum of phenotypes. A simplification of this spectrum relies on two main groups, pro-inflammatory macrophages, able to amplify the inflammatory immune response and anti-inflammatory macrophages, able to mitigate the inflammatory reaction. Due to their critical role in both cardiac inflammatory and reparative activities, we hypothesised that macrophages had a role in contributing to cardiac EndMT. Indeed, we identified an increase in macrophages in fibrotic regions of human myocardial infarction hearts, aortic stenosis and diabetic myocardiopathy. Increased macrophage populations were also identified in murine fibrotic models of aortic banding and AngII infusion. Moreover, it was found that macrophages were closely associated with endothelial cells undergoing EndMT in a murine model of atherosclerosis. We therefore established the tools to investigate a direct link between macrophages and EndMT. We generated distinct murine macrophage lines and characterised resident peritoneal macrophages, polarised bone marrow-derived macrophages and the polarised RAW264.7 macrophage cell line. Three different in vitro cell culture systems were then established to analyse unidirectional paracrine signalling, bidirectional paracrine signalling, and juxtacrine signalling between endothelial cells and macrophages. As a control, EndMT was induced in mouse cardiac endothelial cells with TGF-Beta and inflammatory cytokines. These results demonstrated that indeed macrophages alone induce EndMT via a juxtacrine cell-cell contact manner but not under paracrine conditions. Interestingly, we found that pro-inflammatory TLR-stimulated bone marrow-derived macrophages showed enhanced induction of EndMT compared with anti-inflammatory bone marrow-derived macrophages. Moreover, pro-inflammatory TLR-stimulated RAW 264.7 cells, but neither native nor anti-inflammatory RAW 264.7 cells, induced EndMT. We additionally found that pro-inflammatory RAW 264.7 cells induced-EndMT and were associated with induction of the Notch signalling pathway; a juxtacrine signalling pathway known to induce EndMT during embryonic development. Next the vice versa impact of EndMT on macrophage polarisation phenotype was investigated. We found that EndMT cells hindered the macrophage activation phenotype by down-regulation of pro-inflammatory markers TNF-alpha, MHCII and CCL2 in a paracrine related manner. EndMT also inhibited anti-inflammatory and pro-fibrotic macrophage markers. In summary, this PhD thesis describes the crosstalk between macrophages and cardiac endothelial cells undergoing EndMT.de
dc.contributor.coRefereeNikolaev, Viacheslav Prof. Dr.
dc.subject.gercardiac fibrosisde
dc.subject.engmacrophagesde
dc.subject.engcardiac fibrosisde
dc.subject.engendmtde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3EB7-4-8
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultät
dc.subject.gokfullMedizin (PPN619874732)de
dc.subject.gokfullmolecular medicinede
dc.identifier.ppn894568663


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