Pore-spanning lipid membranes as a tool to study membrane permeabilization  by antimicrobial peptides

Pore-spanning lipid membranes as a tool to study membrane permeabilization by antimicrobial peptides

Neubacher, Henrik

Doctoral thesis

Date of Examination: 2017-03-09

Date of issue: 2017-09-06

Advisor: Steinem, Claudia Prof. Dr.

Referee: Steinem, Claudia Prof. Dr.

Referee: Jahn, Reinhard Prof. Dr.

Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3EF3-B

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Name: Dissertation_Henrik_Neubacher.pdf

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Abstract

English

Antimicrobial peptides (AMPs) have a high therapeutic potential in combating microbial diseases. Their modes of action are still not well understood, and screening methods to identify and improve AMPs are needed. This work explores the use of pore-spanning lipid membranes as a model system to assay AMP activity, and to investigate their modes of action. Different porous substrates are tested and evaluated for their suitability for chip-based dye translocation assays that monitor the ability of an aqueous dye to move across a lipid bilayer. Three porous substrates with different porosity, optical and surface characteristics were tested: open pore silicon nitride, closed pore silica, and closed pore anodic aluminium oxide (AAO) substrates. Lipid bilayer patches were created by spreading dye-doped giant unilamellar vesicles on the porous surface. The spreading process and membrane characteristics were characterized using confocal laser scanning microscopy in a time-resolved manner. Using the AAO support, a dye inflow assay was established. The AMPs melittin and magainin-2 were tested for their effects on lipid bilayers by monitoring dye translocation and changes in membrane fluorescence in response to administration of the respective AMP. Qualitative and quantitative measurements of the changes in membrane permeability gave insights into possible modes of action. Results suggest that melittin, but not magainin-2, acts in part by removing material from the membrane. Meanwhile, magainin-2 but not melittin is able to form pores whose size correlates with the concentration of the peptide. Finally, the assay indicated a preference of magainin-2 and δ-lysin for the liquid disordered phase of phase-separated membranes. With this, the ground work was laid for the development of an assay suitable to screen compounds for AMP activity, efficiency and efficacy, specificity and toxicity. The setup can also be used to investigate details of the modes of action of different AMPs. It has the potential for an on-chip screening platform for high throughput purposes, and applications beneficial for the in vitro research on new antimicrobial agents.

Keywords: Antimicrobial peptides; Pore-spanning lipid membranes; Anodic aluminium oxide; AAO; AMP; PSM

German

Antimikrobielle Peptide (AMPs) haben ein hohes therapeutisches Potential bei der Bekämpfung mikrobieller Krankheiten. Ihre Wirkungsweisen sind immer noch nicht vollständig aufgeklärt, und Screening-Methoden zur Identifizierung und Verbesserung von AMPs werden benötigt. Diese Arbeit untersucht porenüberspannende Membranen als potenzielles Testsystem für die Prüfung von Substanzen auf AMP-Aktivität sowie die Erforschung der Wirkungsweise von AMPs. Verschiedene feste Trägerstoffe wurden auf ihre Eignung für Chip-basierte Farbstoff-Translokationstests geprüft. Hierbei wurde die Fähigkeit eines AMPs, die Lipidmembran zu perforieren, mit Hilfe eines wasserlöslichen Farbstoffes gezeigt. Drei Trägerstoffe wurden getestet: offenporige Siliziumdioxid-, geschlossenporige Siliziumnitrid- sowie geschlossenporige Substrate aus anodischem Aluminiumoxid (AAO). Porenüberspannende Membranen wurden durch Spreiten von farbstoffdotierten giant unilammellar vesicles erzeugt. Der Spreitprozess sowie die Eigenschaften der gebildeten planaren porenüberspannenden Membranen wurden mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Parameter für eine robuste Überwachung in räumlicher als auch Zeitdimension wurden erarbeitet. Mit AAO als Trägersubstanz wurde ein Farbstoff-Einströmungstest etabliert. Mit diesem Test wurde untersucht, auf welche Weise die AMPs Melittin und Magainin-2 die Membran verändern. Erkenntnisse darüber wurden anhand der Beobachtung von Membranfluoreszenz und Durchlässigkeit für verschieden große wässrige Farbstoffe gewonnen. Qualitative und quantitative Untersuchungen der Veränderung der Membrandurchlässigkeit gaben Einblicke in mögliche Wirkungsweisen der untersuchten AMPs. Die Ergebnisse legen nahe, dass Melittin, nicht aber Magainin-2,seine Wirkung zum Teil durch Entfernen von Membranmaterial entfaltet. Im Gegensatz dazu zeigte Magainin-2, nicht aber Melittin, eine konzentrationsabhängige Variabilität in der Größe geformter Poren. Schließlich konnte gezeigt werden dass Magainin-2 und δ-Lysin in phasenseparierten Membranen die liquid disordered Phase bevorzugen. In dieser Arbeit wurden die Forschungsgrundlagen für die Entwicklung eines Tests zur systematischen Suche nach AMPs bezüglich Effizienz und Wirksamkeit, Spezifität und Toxizität gelegt. Die Untersuchungsmethode erlaubt die Erforschung der Wirkungsweisen verschiedener AMPs. Damit hat die hier etablierte Methode das Potenzial für einen Chip-basierten Schnelltest auf die antimikrobiellen Eigenschaften von Kandidatensubstanzen.