Etablierung eines Nachweisverfahrens zur Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Verteilung mitochondrial translatierter Proteine mit hochauflösender STED-Mikroskopie durch metabolische Markierung mit nicht-kanonischen Aminosäuren

Heuser, Moritz Fabian

dc.contributor.advisor	Jakobs, Stefan Prof. Dr.
dc.contributor.author	Heuser, Moritz Fabian
dc.date.accessioned	2017-09-14T08:05:52Z
dc.date.available	2017-09-14T08:05:52Z
dc.date.issued	2017-09-14
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3F02-3
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6487
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc	570	de
dc.title	Etablierung eines Nachweisverfahrens zur Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Verteilung mitochondrial translatierter Proteine mit hochauflösender STED-Mikroskopie durch metabolische Markierung mit nicht-kanonischen Aminosäuren	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Development of a protocol for the investigation of the spacial and temporal distribution of mitochondrially translated proteins with high resolution STED microscopy using metabolic labeling with non-canonical amino acids	de
dc.contributor.referee	Jakobs, Stefan Prof. Dr.
dc.date.examination	2017-05-02
dc.description.abstractger	Die metabolische Markierung naszierender Polypeptide mit nicht-kanonischen Aminosäuren ist ein mächtiges Werkzeug für die Analyse des zellulären Proteoms. Über das Einbringen bioorthogonaler funktioneller Gruppen ermöglicht es in einer anschließenden Nachweisreaktion den direkten Zugriff auf die Subpopulation der in einem frei gewählten Zeitraum translatierten Proteine. Diese Methode ist in der Vergangenheit bereits sowohl für cytosolische Proteinsynthese eukaryotischer Zellen, als auch für prokaryotische Proteinsynthese angewendet worden. Mitochondrien sind endosymbiotisch entstandene Organellen, die sich ihr eigenes Genom erhalten haben, das neben funktionalen RNAs ausschließlich für einige essentielle Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe codiert. Basierend auf dem Import kerncodierter Proteine unterhalten sie darüber hinaus eine eigene Proteinsynthese- Maschinerie, die sich stark von ihrem cytosolischen Gegenstück, aber auch von ihrem Ursprung, dem bakteriellen System, unterscheidet. Diese Arbeit zeigt erstmalig, dass das Methionin-Analog Homopropargylglycin (HPG), eine nicht-kanonische Aminosäure die ein terminales Alkin trägt, anstelle von Methionin in mitochondrial translatierte Proteine eingebaut wird und dort über die kupferkatalysierte 1,3-dipolare Cycloaddition (CuAAC) mit einer Azid-funktionalisierten Sonde nachgewiesen werden kann. Dies wird anhand der Affinitätsaufreinigung mitochondrialer Translationsprodukte nach differentiellem Einsatz der Proteinsyntheseinhibitoren Cycloheximid und Thiamphenicol im Western Blot demonstriert und mit massenspektrometrischen Daten, die den Einbau von HPG in mitochondrial translatierte Proteine zeigen, belegt. Zusätzlich wird gezeigt, dass sich die mitochondriale Proteinsynthese auch in intakten fixierten Zellen fluoreszenzmarkieren und in situ mit hochauflösender STED-Mikroskopie abbilden lässt, obwohl die direkte Kopplung eines Fluorophors an eine nicht kanonische Aminosäure viel dunkler ist als eine Antikörper-Färbung. Damit legt diese Arbeit den Grundstein für die Untersuchung der räumlichen Verteilung der Proteinsynthese im mitochondrialen Netzwerk mit bisher unerreichter Präzision, weil der Abstand zwischen der markierten nicht-kanonischen Aminosäure und der Fluoreszenz-Sonde um ein Vielfaches geringer ist als im Falle einer Antikörper-Dekoration. Die Entwicklung einer Azid-funktionalisierten Sonde, die diesem Problem begegnet, indem sie mehr als ein Fluorophor trägt, wird in zukünftigen Arbeiten eine hochauflösende Abbildung der mitochondrialen Translation in variablen Zeiträumen auch in Mehrfachfärbungen gegen andere Strukturen ermöglichen.	de
dc.description.abstracteng	Metabolic labeling of nascent polypeptides using non-canonical amino acids is a valuable tool enabling researchers to introduce bioorthogonal functional groups into proteins. These can subsequentially be used for identifying the subset of proteins synthesized in a defined time window. This method has already been applied to analyze protein synthesis in the cytoplasm of both eukaryotic and prokaryotic cells. Mitochondria are organells of endosymbiontic origin that have maintained their own genome coding for some functional RNAs and a few subunits of the respiratory complexes. Based on the import of cytosolic proteins, mitochondria furthermore possess everything needed for protein synthesis. The mitochondrial protein synthesis however differs strongly from both its cytosolic counterpart and its ancestor, the bacterial system. This study shows, for the first time, the incorporation of the methionine-mimic homopropargylglycine (HPG) into mitochondrially translated proteins. HPG introduces a terminal alkyne into the proteins which can subsequently be detected with an azidefunctionalized probe via copper catalyzed 1,3 dipolar cycloaddition (CuAAC). This was demonstrated by using cycloheximide and thiamphenicol for differential inhibition of protein synthesis, affinity purification of the labeled mitochondrial translation products and their subsequent detection in Western blot. HPG incorporation into these proteins was confirmed by mass spectrometric analysis. Further, the mitochondrial protein synthesis was labeled with an azide-functionalized fluorophore in fixed cells and detected in situ using high-resolution STED microscopy, although the one fluorophore per HPG approach was very dim. Altogether, this work establishes a new method for measuring the nanoscale distribution of mitochondrial protein synthesis, because direct labeling with HPG brings the fluorescent probe much closer to the protein than an antibody staining. If a future study were able to cope with the problem of brightness, e.g. by synthesizing an azide-modified probe bearing more than one fluorophore, then even multi-color imaging with other structures will be possible.	de
dc.contributor.coReferee	Teichmann, Thomas PD Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Rehling, Peter Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Schwappach, Blanche Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Braus, Gerhard Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Kehlenbach, Ralph Prof. Dr.
dc.subject.ger	metabolische Markierung	de
dc.subject.ger	nicht-kanonische Aminosäuren	de
dc.subject.ger	mitochondriale Translation	de
dc.subject.ger	STED	de
dc.subject.ger	Proteinsynthese	de
dc.subject.ger	Mitochondrien	de
dc.subject.ger	CuAAC	de
dc.subject.ger	Click-Chemie	de
dc.subject.eng	metabolic labeling	de
dc.subject.eng	non canonical amino acids	de
dc.subject.eng	mitochondrial translation	de
dc.subject.eng	STED	de
dc.subject.eng	protein synthesis	de
dc.subject.eng	mitochondria	de
dc.subject.eng	CuAAC	de
dc.subject.eng	click chemistry	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3F02-3-0
dc.affiliation.institute	Biologische Fakultät für Biologie und Psychologie	de
dc.subject.gokfull	Biologie (PPN619462639)	de
dc.identifier.ppn	100491637X 1000142965

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Fakultät für Biologie und Psychologie (inkl. GAUSS) [1621]

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