Gerichtete Evolution und Charakterisierung von Bakteriophytochromen für die tiefrote, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Directed evolution and characterization of bacteriophytochromes for deep-red, high-resolution fluorescence microscopy
by Maria Kamper
Date of Examination:2017-07-06
Date of issue:2017-10-18
Advisor:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Referee:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Referee:Dr. Till Ischebeck
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Name:17.10.11_Dissertation_Maria_Kamper_21231026_fwv.pdf
Size:34.9Mb
Format:PDF
Abstract
English
The green fluorescent protein (GFP) and its homologues have revolutionized molecular biology through their considerable utility as genetic probes, among myriad other applications. Moreover, in recent decades, the extraordinary potential of photomodulatable GFP-based proteins has invited particular interest within the scientific community. Due to their unique properties and resultant versatility across a spectrum of applications, the further discovery and development of reversibly switchable fluorescent proteins (RSFPs), a subclass of photomodulatable FPs, attracted even more attention. Most notably, these proteins have facilitated the implementation of the Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions (RESOLFT) principle. To date, no GFP-based FPs and especially RSFPs have been developed for use in the spectral range below 680 nm, thus precluding application in the near infrared range (NIR, 650 nm-900 nm). However, minimal absorption of these wavelengths by hemoglobin and water as well as low autofluorescence and scattering properties make this optical window ideal for many methods that require light to penetrate living cells or organisms. Phytochromes are photoreceptors capable of absorbing deep-red and near infrared wavelength light and incorporate linear tetrapyrrols as chromophors. The bacteriophytochrome subclass incorporates biliverdin, a chromophore that also occurs naturally in mammals, and exhibits spectral properties in the NIR region. In light of these properties, bacteriophytochromes have been increasingly used as a template for the generation of new NIR FPs since 2009. The present work describes the development of bacteriophytochrome-based (RS)FPs, thereby opening the NIR optical window for STED (STimulated Emission Depletion) and RESOLFT nanoscopic methods. Due to the special requirements for screening of NIR (RS)FPs with an external chromophore, a new system was developed for screening in both E. coli- and mammalian cells. Various monomerized and truncated variants of the PAS-GAF-PHY domains of D. radiodurans bacteriophytochrome were chosen as templates for optimization using this screening system. In the first part of this dissertation, a new NIR FP is generated. This NIR FP (W4.35) shows superior properties in cellular brightness, molecular brightness and pH-stability in comparison to the other variants investigated in this work. Furthermore, it shows high bleaching stability as well as good suitability as part of carboxy- and aminoterminal fusion proteins. Using W4.35, STED nanoscopy was performed in the NIR optical window for the first time, with all imaging performed in living cells. An 860 nm STED beam enabled resolution below 80 nm, opening a completely new wavelength range in STED nanoscopy. The second half of this dissertation describes the development of NIR RSPFs subsequently characterized and implemented in confocal microscopy and RESOLFT nanoscopy of living cells. Positional screening determined the influence of different amino acid substitutions on the characteristics of each variant, facilitating further generation and optimization of NIR RSFPs in future studies. This screening process significantly improved the switching background of investigated variants, a common limiting factor in the application of RESOLFT nanoscopy. Importantly, all variants are more stable to bleaching than GFP-based RSFPs. With an optical setup customized for the use of NIR RSFPs, confocal microscopy as well as a detailed characterization of switching properties under confocal conditions were performed. The latter allowed the evaluation of suitable parameters for the first successful performance of RESOLFT nanoscopy with an NIR RSFP. In summary, with the development of near infrared standard and reversibly switchable fluorescent proteins in this work, imaging in the near infrared region is now attainable with STED and RESOLFT nanoscopy.
Keywords: nanoscopy; bacteriophytochromes; STED; RESOLFT; fluorescent proteins
German
Das grün fluoreszierende Protein (green fluorescent protein, GFP) und seine Homologe haben, unter anderem durch ihre Verwendbarkeit als genetische Sonden, die Molekularbiologie revolutioniert. In den letzten Jahrzehnten zeigte sich außerdem das große Potential photomodulierbarer GFP-basierter Proteine. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften und der sich daraus ergebenden Anwendungsmöglichkeiten erregte hier vor allem die Entdeckung der neuen Proteinklasse der reversibel schaltbaren FPs (reversible switchable fluroescent proteins, RSFPs) Aufmerksamkeit. Insbesondere die Verwirklichung des RESOLFTPrinzips (Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions) demonstrierte hierbei das Potential dieser Proteinklasse. Sowohl die Klasse der GFP-basierten FPs als auch insbesondere die der GFP-basierten RSFPs ist auf den spektralen Bereich unter 680 nm beschränkt. Der nahe Infrarotlichtbereich (Near InfraRed, NIR, 650- 900 nm), konnte somit nicht genutzt werden. Dieses optische Fenster ist, aufgrund der minimierten Absorption von Hämoglobin und Wasser sowie der geringen Autofluoreszenz und Streuung, bevorzugt für viele Methoden bei denen Licht lebende Zellen oder Organismen penetriert. Phytochrome gehören zu den im tiefroten Wellenlängenbereich des Lichts und dem nahen Infrarotlicht absorbierenden Photorezeptoren und inkorporieren lineare Tetrapyrrole als Chromophor. Die Untergruppe der Bakteriophytochrome inkorporiert mit Biliverdin ein natürlicherweise in Säugern vorkommendes Chromophor und zeigt spektrale Eigenschaften im NIR-Bereich des Lichts. Aus diesem Grund, wird die Gruppe der Bakteriophytochrome seit 2009 zunehmend als Vorlage für die Generierung neuer NIR FPs verwendet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Bakteriophytochrom-basierte (RS)FPs für die Nanoskopie generiert werden und somit der Bereich des nahen Infrarotlichts für die Nanoskopiemethoden STED (STimulated Emission Depletion) und RESOLFT zugänglich gemacht werden. Aufgrund der speziellen Anforderungen eines Screenings nach NIR (RS)FPs mit externem Chromophor, wurde ein neues, kombiniertes Screeningsystem entwickelt, welches das Screening in E. coli- und Säugerzellen kombiniert. Als Basis für dieses Screening wurden verschiedene, monomerisierte und verkürzte Varianten der PAS-GAFPHY- Domänen des Bakteriophytochroms aus D. radiodurans gewählt. Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein neues NIR FP generiert. Dieses NIR FP (W4.35) weist, im Vergleich zu den anderen in dieser Arbeit generierten beziehungsweise untersuchten Varianten, überlegene Eigenschaften bezüglich der zellulären Helligkeit, der molekularen Helligkeit beziehungsweise der pHStabilität auf. Außerdem zeigt W4.35 eine hohe Bleichstabilität sowie eine gute Eignung als carboxy- und aminoterminales Fusionsprotein. Unter Verwendung von W4.35 konnte erstmals STED-Nanoskopie im NIR Wellenlängenbereich des Lichts durchgeführt werden. Hierbei dienten lebende Zellen als Probe. Mit einer STED-Wellenlänge von 860 nm, wurde eine Auflösung von unter 80 nm erreicht und wird ein komplett neuer Wellenlängenbereich für die STED-Nanoskopie eröffnet. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden erstmalig NIR RSFPs generiert, charakterisiert und für die konfokale Mikroskopie sowie die RESOLFT-Nanoskopie lebender Zellen verwendet. Mittels einer Positionsstudie konnte der Einfluss verschiedener Aminosäuresubstitutionen auf die Charakteristika der Varianten gezeigt werden. Dies eröffnet die Möglichkeit einer gezielteren Mutagenese bei der zukünftigen Generierung und Optimierung von NIR-RSFPs. Im Rahmen des Screenings wurde insbesondere der Schalthintergrund, als einer der die Anwendung in der RESOLFT-Nanoskopie limitierenden Faktoren, maßgeblich verbessert. Alle Varianten sind hierbei deutlich bleichstabiler als GFP-basierten RSFPs. Mit Hilfe eines im Rahmen der vorliegenden Arbeit konstruierten, auf die Anwendung von NIR RSFPs optimierten, optischen Aufbaus wurde die erstmalige konfokale Mikroskopie sowie die detaillierte Charakterisierung der Schalteigenschaften unter konfokalen Bedingungen durchgeführt. Letztere ermöglichte die Evaluierung geeigneter Parameter für die erfolgreiche erste Durchführung der RESOLFTNanoskopie unter Verwendung eines der generierten NIR RSFPs. Mit den im Rahmen dieser Arbeit erstellten NIR FPs und RSFPs wurde der NIR Wellenlängenbereich des Lichts für die Nanoskopie-Methoden STED und RESOLFT zugänglich gemacht.
Schlagwörter: Nanoskopie; Bakteriophytochrome; STED; RESOLFT; Fluoreszenzproteine