| dc.contributor.advisor | Jakobs, Stefan Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Kamper, Maria | |
| dc.date.accessioned | 2017-10-18T11:01:59Z | |
| dc.date.available | 2018-07-04T22:50:05Z | |
| dc.date.issued | 2017-10-18 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3F3A-7 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6538 | |
| dc.language.iso | deu | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 570 | de |
| dc.title | Gerichtete Evolution und Charakterisierung von Bakteriophytochromen für die tiefrote, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.title.translated | Directed evolution and characterization of bacteriophytochromes for deep-red, high-resolution fluorescence microscopy | de |
| dc.contributor.referee | Jakobs, Stefan Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2017-07-06 | |
| dc.description.abstractger | Das grün fluoreszierende Protein (green fluorescent protein, GFP) und seine Homologe haben, unter anderem
durch ihre Verwendbarkeit als genetische Sonden, die Molekularbiologie revolutioniert. In den letzten
Jahrzehnten zeigte sich außerdem das große Potential photomodulierbarer GFP-basierter Proteine.
Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften und der sich daraus ergebenden Anwendungsmöglichkeiten
erregte hier vor allem die Entdeckung der neuen Proteinklasse der reversibel schaltbaren FPs (reversible
switchable fluroescent proteins, RSFPs) Aufmerksamkeit. Insbesondere die Verwirklichung des RESOLFTPrinzips
(Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions) demonstrierte hierbei das Potential dieser
Proteinklasse.
Sowohl die Klasse der GFP-basierten FPs als auch insbesondere die der GFP-basierten RSFPs ist auf den
spektralen Bereich unter 680 nm beschränkt. Der nahe Infrarotlichtbereich (Near InfraRed, NIR, 650-
900 nm), konnte somit nicht genutzt werden. Dieses optische Fenster ist, aufgrund der minimierten
Absorption von Hämoglobin und Wasser sowie der geringen Autofluoreszenz und Streuung, bevorzugt für
viele Methoden bei denen Licht lebende Zellen oder Organismen penetriert.
Phytochrome gehören zu den im tiefroten Wellenlängenbereich des Lichts und dem nahen Infrarotlicht
absorbierenden Photorezeptoren und inkorporieren lineare Tetrapyrrole als Chromophor. Die Untergruppe
der Bakteriophytochrome inkorporiert mit Biliverdin ein natürlicherweise in Säugern vorkommendes
Chromophor und zeigt spektrale Eigenschaften im NIR-Bereich des Lichts. Aus diesem Grund, wird die
Gruppe der Bakteriophytochrome seit 2009 zunehmend als Vorlage für die Generierung neuer NIR FPs
verwendet.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Bakteriophytochrom-basierte (RS)FPs für die Nanoskopie
generiert werden und somit der Bereich des nahen Infrarotlichts für die Nanoskopiemethoden STED
(STimulated Emission Depletion) und RESOLFT zugänglich gemacht werden. Aufgrund der speziellen
Anforderungen eines Screenings nach NIR (RS)FPs mit externem Chromophor, wurde ein neues,
kombiniertes Screeningsystem entwickelt, welches das Screening in E. coli- und Säugerzellen kombiniert. Als
Basis für dieses Screening wurden verschiedene, monomerisierte und verkürzte Varianten der PAS-GAFPHY-
Domänen des Bakteriophytochroms aus D. radiodurans gewählt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein neues NIR FP generiert. Dieses NIR FP (W4.35) weist, im Vergleich
zu den anderen in dieser Arbeit generierten beziehungsweise untersuchten Varianten, überlegene
Eigenschaften bezüglich der zellulären Helligkeit, der molekularen Helligkeit beziehungsweise der pHStabilität
auf. Außerdem zeigt W4.35 eine hohe Bleichstabilität sowie eine gute Eignung als carboxy- und
aminoterminales Fusionsprotein. Unter Verwendung von W4.35 konnte erstmals STED-Nanoskopie im
NIR Wellenlängenbereich des Lichts durchgeführt werden. Hierbei dienten lebende Zellen als Probe. Mit
einer STED-Wellenlänge von 860 nm, wurde eine Auflösung von unter 80 nm erreicht und wird ein
komplett neuer Wellenlängenbereich für die STED-Nanoskopie eröffnet.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden erstmalig NIR RSFPs generiert, charakterisiert und für die
konfokale Mikroskopie sowie die RESOLFT-Nanoskopie lebender Zellen verwendet. Mittels einer
Positionsstudie konnte der Einfluss verschiedener Aminosäuresubstitutionen auf die Charakteristika der
Varianten gezeigt werden. Dies eröffnet die Möglichkeit einer gezielteren Mutagenese bei der zukünftigen
Generierung und Optimierung von NIR-RSFPs. Im Rahmen des Screenings wurde insbesondere der
Schalthintergrund, als einer der die Anwendung in der RESOLFT-Nanoskopie limitierenden Faktoren,
maßgeblich verbessert. Alle Varianten sind hierbei deutlich bleichstabiler als GFP-basierten RSFPs. Mit
Hilfe eines im Rahmen der vorliegenden Arbeit konstruierten, auf die Anwendung von NIR RSFPs
optimierten, optischen Aufbaus wurde die erstmalige konfokale Mikroskopie sowie die detaillierte
Charakterisierung der Schalteigenschaften unter konfokalen Bedingungen durchgeführt. Letztere
ermöglichte die Evaluierung geeigneter Parameter für die erfolgreiche erste Durchführung der RESOLFTNanoskopie
unter Verwendung eines der generierten NIR RSFPs.
Mit den im Rahmen dieser Arbeit erstellten NIR FPs und RSFPs wurde der NIR Wellenlängenbereich des
Lichts für die Nanoskopie-Methoden STED und RESOLFT zugänglich gemacht. | de |
| dc.description.abstracteng | The green fluorescent protein (GFP) and its homologues have revolutionized molecular biology through
their considerable utility as genetic probes, among myriad other applications. Moreover, in recent decades,
the extraordinary potential of photomodulatable GFP-based proteins has invited particular interest within
the scientific community. Due to their unique properties and resultant versatility across a spectrum of
applications, the further discovery and development of reversibly switchable fluorescent proteins (RSFPs),
a subclass of photomodulatable FPs, attracted even more attention. Most notably, these proteins have
facilitated the implementation of the Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions
(RESOLFT) principle.
To date, no GFP-based FPs and especially RSFPs have been developed for use in the spectral range below
680 nm, thus precluding application in the near infrared range (NIR, 650 nm-900 nm). However, minimal
absorption of these wavelengths by hemoglobin and water as well as low autofluorescence and scattering
properties make this optical window ideal for many methods that require light to penetrate living cells or
organisms.
Phytochromes are photoreceptors capable of absorbing deep-red and near infrared wavelength light and
incorporate linear tetrapyrrols as chromophors. The bacteriophytochrome subclass incorporates biliverdin,
a chromophore that also occurs naturally in mammals, and exhibits spectral properties in the NIR region.
In light of these properties, bacteriophytochromes have been increasingly used as a template for the
generation of new NIR FPs since 2009.
The present work describes the development of bacteriophytochrome-based (RS)FPs, thereby opening the
NIR optical window for STED (STimulated Emission Depletion) and RESOLFT nanoscopic methods.
Due to the special requirements for screening of NIR (RS)FPs with an external chromophore, a new system
was developed for screening in both E. coli- and mammalian cells. Various monomerized and truncated
variants of the PAS-GAF-PHY domains of D. radiodurans bacteriophytochrome were chosen as templates
for optimization using this screening system.
In the first part of this dissertation, a new NIR FP is generated. This NIR FP (W4.35) shows superior
properties in cellular brightness, molecular brightness and pH-stability in comparison to the other variants
investigated in this work. Furthermore, it shows high bleaching stability as well as good suitability as part of
carboxy- and aminoterminal fusion proteins. Using W4.35, STED nanoscopy was performed in the NIR
optical window for the first time, with all imaging performed in living cells. An 860 nm STED beam enabled
resolution below 80 nm, opening a completely new wavelength range in STED nanoscopy.
The second half of this dissertation describes the development of NIR RSPFs subsequently characterized
and implemented in confocal microscopy and RESOLFT nanoscopy of living cells. Positional screening
determined the influence of different amino acid substitutions on the characteristics of each variant,
facilitating further generation and optimization of NIR RSFPs in future studies. This screening process
significantly improved the switching background of investigated variants, a common limiting factor in the
application of RESOLFT nanoscopy. Importantly, all variants are more stable to bleaching than GFP-based
RSFPs. With an optical setup customized for the use of NIR RSFPs, confocal microscopy as well as a
detailed characterization of switching properties under confocal conditions were performed. The latter
allowed the evaluation of suitable parameters for the first successful performance of RESOLFT nanoscopy
with an NIR RSFP.
In summary, with the development of near infrared standard and reversibly switchable fluorescent proteins
in this work, imaging in the near infrared region is now attainable with STED and RESOLFT nanoscopy. | de |
| dc.contributor.coReferee | Ischebeck, Till Dr. | |
| dc.subject.ger | Nanoskopie | de |
| dc.subject.ger | Bakteriophytochrome | de |
| dc.subject.ger | STED | de |
| dc.subject.ger | RESOLFT | de |
| dc.subject.ger | Fluoreszenzproteine | de |
| dc.subject.eng | nanoscopy | de |
| dc.subject.eng | bacteriophytochromes | de |
| dc.subject.eng | STED | de |
| dc.subject.eng | RESOLFT | de |
| dc.subject.eng | fluorescent proteins | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3F3A-7-3 | |
| dc.affiliation.institute | Biologische Fakultät für Biologie und Psychologie | de |
| dc.subject.gokfull | Biologie (PPN619462639) | de |
| dc.description.embargoed | 2018-07-03 | |
| dc.identifier.ppn | 1002330742 | |