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Einfluss von HDAC-Inhibitoren auf die Expression IFNγ-regulierter Gene und die Parasitenentwicklung in Toxoplasma gondii-infizierten Makrophagen

dc.contributor.advisorLüder, Carsten Prof. Dr.
dc.contributor.authorSumpf, Kristina
dc.date.accessioned2017-11-10T13:58:21Z
dc.date.available2017-12-12T23:50:05Z
dc.date.issued2017-11-10
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3F61-B
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-6571
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610de
dc.titleEinfluss von HDAC-Inhibitoren auf die Expression IFNγ-regulierter Gene und die Parasitenentwicklung in Toxoplasma gondii-infizierten Makrophagende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedImpact of HDAC inhibitors on the expression of IFNγ-regulated genes and parasite development in Toxoplasma gondii-infected macrophagesde
dc.contributor.refereeMeyer, Thomas Prof. Dr.
dc.date.examination2017-12-05
dc.description.abstractgerToxoplasma gondii ist ein weltweit verbreiteter intrazellulärer Parasit aus der Gruppe der Apikomplexa, der nahezu alle Säugetiere, inklusive des Menschen, und Vögel als Zwischenwirt nutzen kann. Zur sexuellen Replikation ist T. gondii jedoch auf feline Enterozyten angewiesen. Die in Europa dominierenden Haplotypen verursachen in Immungesunden meist nur milde, unspezifische Symptome und die akute Infektion geht in eine chronische, asymptomatische Infektion über. Bei Erstinfektion in der Schwangerschaft kann sich eine konnatale Toxoplasmose entwickeln, die bis zum Tod des Fetus führen kann. Des Weiteren sind Immunsupprimierte durch Neuinfektionen oder Reaktivierung einer bestehenden chronischen Infektion gefährdet. Die schnelle intrazelluläre Replikation der Tachyzoiten führt während der akuten Infektion zur Lyse der Wirtszelle und ist damit für die potentiell lebensbedrohlichen Gewebsschäden in Patienten mit verminderter zellulärer Immunreaktion verantwortlich. Der Übergang in eine chronische Infektion ist durch den Stadienwechsel des Parasiten in Bradyzoiten mit niedriger Stoffwechselaktivität und Zystenbildung gekennzeichnet. In diesem Zustand persistiert der Parasit im Wirt lebenslang. Hierfür nutzt T. gondii immunprivilegierte Kompartimente wie Hirn und Skelettmuskulatur. Zur Etablierung einer persistenten Infektion ist ein Gleichgewicht zwischen immunsupprimierenden Mechanismen des Parasiten und Immunantwort des Wirts notwendig, wodurch die Eradikation des Parasiten verhindert wird, ohne den Wirt in seiner Vitalität zu beeinträchtigen. Toxoplasma gondii induziert zum einen die immunmodulierenden Zytokine IL-10 und TGFβ und hemmt zum anderen die Transkription der durch IFNγ regulierten proinflammatorischen Proteine. Einer der zugrundeliegenden potentiellen Mechanismen zur Hemmung der IFNγ-Antwort ist die Interaktion mit dem ChromatinRemodelling der Wirtszelle. Für die Promotoren von ciita, h2eβ und gpb2 wurde eine reduzierte Histonacetylierung in T. gondii-infizierten Wirtszellen nachgewiesen. Lang et al. wiesen außerdem nach, dass Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren die IFNγ-regulierte Expression der sekundären IFNγ-Antwortgene ciita und h2aβ wiederherstellen kann (Lang et al. 2012). In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit HDAC-Inhibitoren weitere primär und sekundär durch IFNγ regulierte Gene in T. gondii-infizierten und nicht infizierten Monozyten/ Makrophagen regulieren können. Darüber hinaus wurde geprüft, ob eine verbesserte IFNγ-Antwort auch mit einer verbesserten Kontrolle der parasitären Vermehrung in Monozyten/ Makrophagen einhergeht. Zum Vergleich der Expression von sekundären und primären Antwortgenen in Anwesenheit und Abwesenheit des HDAC-Inhibitors MS-275 in T. gondii-infizierten IFNγ-stimulierten murinen Monozyten/ Makrophagen wurde eine genomweite High-Throughput-RNA-Analyse sowie RT-qPCRs für die primären Antwortgene irf1, irf8 und das sekundäre Antwortgen ciita durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass MS-275 die Transkriptmengen einer Reihe von primären und der Mehrzahl von sekundären IFNγ-Antwortgenen unabhänging von einer Infektion mit T. gondii erhöht. Jedoch wurde die relative T. gondii-vermittelte Hemmung der IFNγ-regulierten Genexpression der meisten primären und sekundären Antwortgene durch MS-275 nicht deutlich verändert. Somit ist anzunehmen, dass T. gondii die IFNγ-Antwort nicht genomweit durch die Manipulation von HDACs hemmt. Aufgrund der dennoch insgesamt höheren Transkriptmengen wurde geprüft, ob HDAC-Inhibitoren die Parasitenentwicklung in T. gondii-infizierten Monozyten/ Makrophagen beeinflussen. Als Maß für die Abwehrfähigkeit der Makrophagen wurden die Replikationsrate sowie der Anteil T. gondii-infizierter Zellen in der Gesamtpopulation gemessen. Die Replikationsrate wurde auf Populationsebene mittels qPCR bestimmt, indem das parasitäre 529-bpFragment amplifiziert und quantifiziert wurde. Der Anteil infizierter Monozyten/ Makrophagen wurde durchflusszytometrisch mithilfe eines GFPexprimierenden T. gondii-Stamms bestimmt. Im Immunfluoreszenztest wurden zusätzlich die intrazelluläre Replikation und die parasitäre Invasionsfähigkeit beurteilt. In allen Experimenten wurde keine deutliche Verbesserung der Parasitenabwehr in Anwesenheit der HDAC-Inhibitoren MS-275 oder Natriumbutyrat gemessen. Dies korrelierte mit der Beobachtung auf transkriptioneller Ebene, dass nicht nur immunaktivierende IFNγ-Antwortgene in Anwesenheit von MS-275 vermehrt exprimiert wurden, sondern auch immunmodulierende Gene wie il10, il4 und socs2. Daher muss davon ausgegangen werden, dass sich die immunaktivierenden und immunsupprimierenden Effekte von MS-275 in T. gondii-infizierten murinen Monozyten/ Makrophagen die Waage halten. Insofern ist die von Lang et al. angeregte medikamentöse Nutzung von HDAC-Inhibitoren gegen die Toxoplasmose als wenig erfolgsversprechend anzusehen.de
dc.description.abstractengToxoplasma gondii is a world-wide distributed intracellular parasite of the phylum Apicomplexa. It can infect birds and mammals including humans for asexual reproduction thus representing intermediate hosts. However, T. gondii requires feline enterocytes for its sexual replication. The predominant haplotypes in Europe usually cause only mild, unspecific symptoms and acute infections turn into chronic, asymptomatic infections. However, when women encounter primary infection during pregnancy, the fetus can suffer from congenital toxoplasmosis which can even lead to intrauterine death. Furthermore, immunocompromised persons are threatened by primary infection or reactivation of chronic infection. The rapid intracellular replication of tachyzoites during acute infection or during reactivation of chronic infection leads to lysis of host cells and potentially lethal tissue damage in patients with defective cellular immune responses. Transition into a chronic infection is initiated by the parasite‘s differentiation into bradyzoites with low metabolic activities and formation of tissue cysts. In this stage the parasite can persist for the host’s life. To achieve this, T. gondii colonizes immunoprivileged sites like brain and skeletal muscle. For establishing a chronic infection a balance between immune evasion mechanisms of the parasite and the host immune responses is necessary to ensure survival of the parasite and the host. For example, T. gondii induces anti-inflammatory IL-10 and TGFβ and inhibits the transcription of IFNγ-regulated immune response genes. One of the mechanisms to inhibit IFNγ responses is interaction with the chromatin remodeling machinery in infected macrophages. A reduced histone acetylation in T. gondii-infected cells was indeed recognized for the ciita, h2eβ and gpb2 promotors. Lang et al. also showed that histone deacetylase (HDAC) inhibitors can restore IFNγ regulated expression of the secondary response genes ciita and h2aβ in T. gondii-infected cells (Lang et al. 2012). In this study, I examined to what extent HDAC inhibitors regulate IFNγ-regulated primary and secondary response genes in T. gondii-infected and noninfected monocytes/ macrophages on a genome-wide level. Moreover, it was tested whether an HDAC-mediated improved IFNγ response results in better control of parasitic replication in monocytes/ macrophages. A high-throughput RNA analysis was performed to compare the expression of IFNγ-regulated genes in presence or absence of the HDAC inhibitor MS-275 in T. gondii-infected murine monocytes/ macrophages. Additionally, RT-qPCRs were performed for primary response genes irf1 and irf8 and the secondary response gene ciita. The results clearly show that MS-275 enhances the transcription of several primary response genes and the majority of secondary response genes regardless of infection with T. gondii. However, the parasite-mediated inhibition of IFNγ-regulated gene expression was not significantly changed by MS-275. It can therefore be assumed that T. gondii does not inhibit the IFNγ response by specifically manipulating HDACs during infection. Nevertheless, because of the increased expression of various IFNγ response genes after concomitant treatment with MS-275, it was tested whether HDAC inhibitors influence the parasitic replication in T. gondii-infected monocytes/ macrophages. The replication rate of T. gondii and the percentage of T. gondii-infected cells in the total population were used as measures for the anti-parasitic activity of monocytes/ macrophages. The parasite’s replication was measured by amplification and quantification of the T. gondii 529-bp fragment using qPCR. The percentage of infected monocytes/ macrophages was measured by flow cytometry of cells infected with a GFP-expressing strain of T. gondii. In addition an immunofluorescence test was used to assess intracellular replication and invasion of T. gondii. All experiments indicated no significant improvement of the anti-parasitic defense of monocytes/ macrophages treated with the HDAC inhibitors MS-275 or sodium butyrate. This might be due to the fact that MS-275 also increased transcription of anti-inflammatory genes as for instance il10, il4 and socs2 as revealed by RNA high-throughput analysis. Therefore, it is hypothesized that increased immunoregulatory activities in response to MS-275 treatment may counterbalance the increase of IFNγ responses in T. gondii-infected murine monocytes/ macrophages. Together, these data suggest that the use of HDAC inhibitors as a supportive drug against toxoplasmosis does not appear promising.de
dc.contributor.coRefereeOppermann, Martin Prof. Dr.
dc.subject.gerToxoplasma gondiide
dc.subject.gerHDAC-Inhibitorende
dc.subject.gerMS-275de
dc.subject.gerIFNγ-regulierte Genede
dc.subject.engToxoplasma gondiide
dc.subject.engHDAC inhibitorde
dc.subject.engMS-275de
dc.subject.engIFNγ-regulated genesde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3F61-B-7
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullMedizin (PPN619874732)de
dc.subject.gokfullMedizinische Mikrobiologie / Medizinische Virologie / Medizinische Mykologie / Infektionskrankheiten / Hygiene / Impfung / Parasitologie / Tropenmedizin - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875356)de
dc.description.embargoed2017-12-12
dc.identifier.ppn1003848834


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